瞬時轉染真核基因表達調控技術
調節瞬時轉染基因的表達*四環素作為哺乳動物細胞中可誘導基因表達的調控物階段一：pTet-tTAk穩定轉染成纖維細胞培養和轉染細胞1. 在DMEM完全培養液中培養貼壁細胞。轉染前一天，把細胞換到含有0.5μg/ml四環素-HCl（四環素）的DMEM完全培養液中。每個10 cm培養皿中加入足量細胞，使轉染那天，細胞可以有33%的匯合度。2. 在合適的限制性內切酶位點使質粒線性化，并把每秒質粒的濃度調整為≥0.5 mg/ml。10～20μg質粒pTet-tTAk和1～2μg pSV2-His（Tet質粒與帶選擇標記的質粒的摩爾比大約為10：1）與500μl HEPES緩沖液在一個干凈的4 ml聚丙乙烯管中混合。3. DNA混合物中加入32.5μl 2 mol/L CaCl2。立即輕輕振蕩使溶液混勻。溶液在室溫保存，不時地混勻。15～30 min后會形成絮狀沉淀。4. 吸掉步驟1準備的細胞培養......閱讀全文
細胞瞬時轉染步驟
原理：通過脂質體介導轉染法及電穿孔等基因轉染技術，將靶基因導入細胞，一般在轉染后48小時左右，靶基因即可在細胞內表達。根據不同的實驗目的，48小時后即可進行靶基因表達的檢測等實驗。應用：觀察目的基因及其表達蛋白在某種細胞中的功能（短時間即可進行觀察，但效應會很快丟失）。一般流程：1）細胞接種：轉染實
重組蛋白真核表達系統技術平臺的特色
重組蛋白作為生物制藥在醫學中作用顯著，一般用轉基因動物的乳腺產生。重組蛋白真核表達包括酵母表達系統、桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統、腺病毒表達系統等。一般可以正確折疊，包含各種修改。但是價格高，周期長。 重組蛋白真核表達系統技術平臺的特色 快速、highly-stringent篩選：只篩選到高表達穩
常用的細胞轉染方法
轉染是將外源性基因導入細胞內的一種技術，是實驗室工作中經常涉及的基本方法。常規轉染技術可分為兩大類：瞬時轉染和穩定轉染（永久轉染）。前者外源 DNA?/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細胞中可存在多個拷貝數，產生高水平的表達，但通常只持續幾天，多用于啟動子和其它調控元件的分析；后者外源DNA
關于真核生物的基因調控—DNA重排的介紹
改變基因組中有關基因順序結構的基因調控方式。哺乳動物的免疫球蛋白的可變區與恒定區的順序分別由不同的基因片段編碼。它們處于同一染色體上但是相距較遠，中間還有一些編碼連接區的DNA順序。在產生抗體的漿細胞成熟過程中，這三個序列通過染色體重排而成為一個完整的轉錄單位。由于可變區基因片段為數眾多，而且不
關于真核生物的基因調控—修飾作用的介紹
真核細胞修飾 DNA的主要途徑是胞嘧啶(c）在5位上的甲基化反應。5-甲基胞嘧啶通常位于鳥嘌呤（G）的旁邊。可見 GC順序最容易被甲基化。在剛剛完成復制的 DNA分子中只有母鏈（模板鏈）是甲基化的。新生 DNA鏈的甲基化在母鏈的指導下進行。用限制酶進行分析的結果表明在不轉錄的DNA中的GC有 7
關于真核生物的基因調控—RNA分工的介紹
真核生物的基因調控—RNA分工：與原核生物不同，真核生物有三種不同的 RNA多聚酶，它們各自負責不同類型的基因的轉錄。從表中不難看出由RNA多聚酶Ⅰ和Ⅲ轉錄的RNA都與所有細胞的生命活動的基本功能──翻譯有關，而只有 RNA多聚酶Ⅱ才能轉錄結構基因而進一步產生蛋白質。顯然這種分工反映了這三類基因
胞內晶體蛋白基因的釀酒酵母真核表達
實驗概要本實驗將釀酒酵母作為胞內晶體蛋白的攜帶和表達宿主，同時，作為可能的營養體喂養海洋線蟲P. redivivus將所表達的目的蛋白導入線蟲機體，觀察線蟲的生長、發育、繁殖或是死亡情況，探討胞內晶體蛋白對昆蟲病原線蟲以外的線蟲是否具有營養作用。為此，首先構建一種重組大腸桿菌，其所攜帶的重組質粒能夠
原核表達——基因克隆技術
原核表達可以用于檢測（1）發生在原核生物內的基因表達。（2）通過基因克隆技術，將外源目的基因，通過構建表達載體并導入表達菌株的方法，使其在特定原核生物或細胞內表達。實驗方法原理一個完整的表達系統通常包括配套的表達載體和表達菌株。如果是特殊的誘導表達還包括誘導劑，如果是融合表達還包括純化系統或者Tag
原核生物基因表達調控模式及其分子機制
原核生物基因的表達調控最重要的特點是操縱子模式，從調控水平來看主要在轉錄水平，即對RNA合成的調控，翻譯水平次之。通常有兩種方式：①起始調控，即啟動子調控；②終止調控，即衰減子調控。原核基因組的調控機制：通過負調控和正調控因子所進行的復合調控，阻遏蛋白與操縱基因結合，妨礙RNApol與P結合形成開放
重組蛋白真核表達系統與原核表達系統的區別
重組蛋白真核表達采用原核表達系統進行研究，主要方法是將已克隆到目的基因DNA的片段的載體轉化到細菌中，通過IPTG誘導和終純化獲得所需的目的蛋白。其優點是可以在短時間內獲得基因表達產物，所需成本相對較低。? 目前的表達系統各有利弊，但一般理想的表達系統滿足以下幾點：一是特異性，不受其他內源性因素
真核生物翻譯的調控（1）
原核生物基因表達的調控主要在轉錄水平上進行，而真核生物由于RNA較為穩定，所以除了存在轉錄水平的調控以外，在翻譯水平上也進行各種形式的調控。在蛋白質生物合成的起始反應中主要涉及到細胞中的四種裝置,這就是:1.核糖體,它是蛋白質生物合成的場所;2.蛋白質合成的模板mRNA它是傳遞基因信息的媒介;3.可
真核生物翻譯的調控（2）
5′端非翻譯區的二極結構影響到調控蛋白與帽結構的接近，阻礙40S前起始復合體的裝配和在mRNA上的掃描，起負調控的作用。但若二極結構位于 AUG的近下游，（最佳距離為14 nt），將會使移動的40亞基停靠在AUG位點，增強起始反應。真核的系列翻譯起始因子可使二極結構解鏈，使翻譯復合體順利通過
關于基因表達調控的技術簡介
基因調控是現代分子生物學研究的中心課題之一。因為要了解動植物生長發育規律。形態結構特征及生物學功能，就必須搞清楚基因表達調控的時間和空間概念，掌握了基因調控機制，就等于掌握了一把揭示生物學奧秘的鑰匙。基因表達調控主要表現在以下幾個方面： ①轉錄水平上的調控； ②mRNA加工、成熟水平
哺乳動物細胞真核表達系統的優勢有人想知道嗎
? 哺乳動物細胞真核表達系統則是通過脂質體或者是PEI的等轉染試劑在體外通過和質粒形成復合體， 將質粒導入細胞后進行瞬時表達。稱為瞬時表達的原因是因為質粒在真核細胞中不能擴增。并且不斷被細胞所降解，這種表達在一定的時間后就會消失。除非質粒被整合進入細胞的基因組，通過質粒上帶的篩選標記，通過篩選得到
瞬時轉染分析法
摘要： 介紹5種瞬時轉染分析法：瞬時轉染分析法、穩定轉染分析法、體外轉錄分析法、轉基因分析法和同源重組分析法. 1.瞬時轉染分析法 目前有很多功能性分析方法用于研究轉錄調控,最常用的方法是瞬時轉染分析法.該方法是通過一定的轉染程序將含目的調控區
Cell：武漢大學闡明真核基因中的轉錄調控機制
近日，來自武漢大學、加州大學圣地亞哥分校的研究人員在新研究中證實，SR蛋白與7SK和啟動子相關新生(Nascent )RNA協同作用，促進了轉錄過程中停頓的聚合酶釋放。這一研究發現為闡明真核基因中的轉錄調控機制，深入了解相關疾病提供了重要的理論依據。相關論文發表在5月9日的《細胞》(Cell
關于真核生物的基因調控—RNA加工的步驟介紹
RNA加工過程中的調控—真核生物的RNA加工過程主要包括三個步驟： ①在新生RNA的5′端加上一個甲基化的鳥嘌呤核苷酸，形成一個所謂的帽子（cap）即m7GpppN（m7G是7-甲基鳥嘌呤核苷，P是磷酸,N是 RNA的5′端第一個核苷酸）這一過程通常發生在新生鏈完成之前。 ②在轉錄后的RNA
關于真核生物的基因調控—翻譯控制的基本介紹
真核生物的翻譯控制的主要形式是控制mRNA的穩定性。mRNA5′端的加帽作用以及它的3′端的多聚A的加尾作用都有助于 mRNA分子的穩定。在某些真核生物中mRNA進入細胞質以后并不立即作為模板進行蛋白質合成，而是與一些蛋白質結合形成RNA蛋白質（RNP）顆粒，在這種狀態的mRNA半衰期可以延長。
什么是基因表達調控？基因表達調控有什么意義
意義：1.適應環境、維持生長和增殖：生物體賴以生存的外環境是在不斷變化的，為了生存，所有活細胞都必須對外環境變化作出適當反應，調節代謝，以適應環境變化。生物體適應環境、調節代謝的能力與蛋白質分子的生物學功能有關。而蛋白質的水平又受基因表達的調控。2.維持個體發育與分化：多細胞生物調節基因的表達除為適
基因表達的調控
轉錄調控可分為三種主要途徑：1）遺傳調控（轉錄因子與靶標基因的直接相互作用）；2）調控轉錄因子與轉錄機制相互作用，3）表觀遺傳調控（影響轉錄的DNA結構的非序列變化）。通過轉錄因子直接調控靶標DNA表達是最簡單和最直接的轉錄調控改變轉錄水平的方法。基因的編碼區周圍通常都具有幾個蛋白質結合位點，具有調
脂質體介導的瞬時轉染
實驗材料?靶細胞DNA試劑、試劑盒?陽離子脂質D-PBSA緩沖鹽溶液NaCl 0.25%胰蛋白酶儀器、耗材?細胞培養基還原的血清培養基無血清培養基多孔培養板實驗步驟 A . 貼壁細胞的轉染1. 將 1.3X105 個細胞/孔接種到 6 孔培養板，加 3 ml 培養基。2. 于 37°C 的 CO2
脂質體介導的瞬時轉染
實驗材料靶細胞DNA試劑、試劑盒陽離子脂質D-PBSA緩沖鹽溶液NaCl0.25%胰蛋白酶儀器、耗材細胞培養基還原的血清培養基無血清培養基多孔培養板實驗步驟A . 貼壁細胞的轉染1. 將 1.3X105?個細胞/孔接種到 6 孔培養板，加 3 ml 培養基。2. 于 37°C 的 CO2?孵箱培養至
脂質體介導的瞬時轉染
? ? ? ? ? ? 實驗材料 靶細胞 DNA 試劑、試劑盒 陽離子脂質 D-PBSA緩沖鹽溶液 Na
關于瞬時轉染的優點介紹
瞬時轉染（transient transfection）是將DNA導入真核細胞的方式之一。在瞬時轉染中，重組DNA導入感染性強的細胞系以獲得目的基因暫時但高水平的表達。轉染的DNA不必整合到宿主染色體，可在比穩定轉染較短時間內收獲轉染的細胞，并對溶解產物中目的基因的表達進行檢測。 第一、操作簡
關于真核生物的基因調控—染色質丟失的介紹
染色質丟失— 在發育過程中一些體細胞失去了某些基因，這些基因便永不表達，這是一種極端形式的不可逆的基因調控。 在某些線蟲、原生動物、甲殼動物發育過程中的體細胞有遺傳物質丟失現象。在這些生物中，只有生殖細胞才保留著該種生物基因組的全套基因。例如在馬副蛔蟲(Ascaris megacephala)
關于真核生物的基因調控—染色質活化的介紹
染色質處在固縮的狀態稱為異染色質化。在異染色質化部位的基因的轉錄活性顯著降低。真核生物可以改變染色體某一區域的異染色質化的程度而控制基因的表達。雌性哺乳動物細胞中的一個 X染色體的失活便是高度異染色質化的結果（見劑量補償效應）。基因由于改變位置而處在異染色質區附近時，轉錄作用也會受到阻礙（見位置
關于真核生物的基因調控—翻譯后控制的基本介紹
翻譯后控制的事例不多。一般認為腦垂體后葉細胞產生的促腎上腺皮質激素和脂肪酸釋放激素是由同一原始翻譯產物經不同的加工而形成的。迄今為止對于真核生物基因調控作用的了解仍然處在探索的階段，特別是對于高等動植物的基因調控過程了解得更少，還不能形成一個完整的模式。1972年美國學者E.戴維森和R.J.布里
什么是瞬時表達和穩定表達？
瞬時表達：外源片段不能隨細胞分裂而一同復制，導致表達時間短暫，且表達量隨時間逐漸下降。穩定表達：是指外源片段整合入細胞基因組中，并能隨細胞分裂穩定傳遞下去，表達量長時間處于穩定水平。那穩定株，顧名思義當然是屬于穩定表達的體系了。
?轉錄水平調控的概念和方式
轉錄水平調控是真核基因表達調控的重要環節。根據真核基因表達是否受環境影響可分為：發育調控和瞬時調控。其中發育調控是指真核生物為確保自身生長、發育、分化等對基因表達按“預定”和“有序”的程序進行的調控，是不可逆的過程；瞬時調控是指真核生物在內、外環境的刺激下所做出的適應性轉錄調控，是可逆過程。
關于蛋白表達系統—哺乳動物表達系統的介紹
哺乳動物細胞表達外源重組蛋白可利用質粒轉染和病毒載體的感染。利用質粒轉染獲得穩定的轉染細胞需幾周甚至幾個月時間，而利用病毒表達系統則可快速感染細胞，在幾天內使外源基因整合到病毒載體中，尤其適用于從大量表達產物中檢測出目的蛋白。哺乳動物細胞表達載體必須包含原核序列、啟動子、增強子、選擇標記基因、終