circRNA機制研究匯總（二）

結合蛋白：
（2）CircNfix與Ybx1結合并促進其降解：circNfix和對照組的蛋白質譜分析（A）。采用Ybx1、Nedd4l或陰性IgG抗體進行RIP實驗（云序生物提供該服務）（B）。P0 CMs中過表達circNfix后Ybx1蛋白表達水平（C-D）。qRT-PCR檢測P0 CMs中Ybx1 mRNA表達水平（E）。RNA FISH在P0 CMs中過表達和不表達circNfix時， circNfix和Ybx1的亞細胞共定位（F）。分餾實驗表明，circNfix過表達促進了Ybx1在細胞質中的易位，增加了Ybx1在細胞質中的降解（G）。在circNfix和Ybx1干擾后，細胞周期蛋白A2和細胞周期蛋白B1的表達水平（H）。ChIP-qPCR（云序生物提供該服務）檢測顯示，cyclin A2和cyclin B1啟動子中Ybx1結合位點擴增（I）。細胞裂解物用抗Ybx1抗體免疫沉淀，用泛素(Ub)特異性抗體、抗Ybx1抗體或抗nedd4l抗體免疫印跡分析進行WB分析。過表達circNfix的CMs中Ybx1蛋白表達水平（K-L）。

ceRNA機制：
（3）circNfix與miR-214的相互作用：預測miR-214和miR-761能夠與circNfix結合（A）。成年小鼠心臟中下調circNfix后，miR-214和miR-761的表達（B）。雙熒光報告實驗檢測miR-214和circNfix能夠直接結合（C）。RNA pull-down（云序生物提供該服務）實驗檢測circNfix能夠拉下miR-214（D）。RNA FISH實驗檢測P0 CMs中，miR-124和circNfix能夠共定位在胞質中（E）。RNA FISH實驗檢測P0 CMs中，miR-124和Gsk3β能夠共定位在胞質中（F）。雙熒光報告實驗檢測miR-214和Gsk3β 3’UTR直接結合（G）。WB檢測干擾circNfix后Gsk3β蛋白的表達水平（H）。WB檢測干擾或過表達miR-124后Gsk3β蛋白的表達水平（I）。WB檢測干擾circNfix和miR-214后Gsk3β蛋白的表達水平（J）。CMs中，干擾circNfix后β-catenin的表達水平（K）。CMs中，干擾Meis1后Meis1和 Gsk3β的表達水平（L）。CMs中，干擾Meis1和circNfix后GSK3β的表達水平（M）。干擾circNfix, Ybx1, miR-214 和 Gsk3β后，P7 CMs進行pH3 和 Aurora B免疫染色（N）。

總結

circNfix如何通過與Ybx1和miR-214結合來調控心臟再生過程：轉錄因子Meis1與circNfix的SE結合后，抑劑circNfix的表達，缺失的circNfix能夠增強Ybx1與Nedd4l (E3泛素連接酶)的相互作用，并誘導Ybx1發生泛素化降解，并進一步抑制下游cyclin-A2和cyclin-B1的表達。同時，缺失的circNfix能夠，降低對miR-214的吸附，進一步抑制Gsk3β及VEGF的表達，最終促進心肌梗死后心臟再生修復和功能恢復。