mRNA的分離和純化實驗（一）

實驗原理

從細胞或組織中得到RNA是一種混合物，其中包括tRNA，rRNA和mRNA，其中RNA為75％～ 85％，tRNA占10％～16％，而mRNA僅占1%～5％，并且mRNA基因序列不同，分子量大小不均一，各基因的表達豐度也不一樣。每克細胞可分離出5-10mg RNA。

真核生物mRNA具有5’端帽子結構（m7G）和3’端的poly(A)尾巴。絕大多數哺乳動物細胞的3’端存在20-300個腺苷酸組成的poly（A）尾，這種結構為真核mRNA分子的分離和純化，提供了極為方便的條件，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的實驗理論就在于此。

一般mRNA分離純化的原理就是根據mRNA 3’端含有poly(A)尾巴結構特性設計的。當總RNA流經寡聚（dT）（即oligo(dT)）纖維素柱時，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異地吸附在oligo(dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸餾水中，mRNA可被洗下，經過oligo(dT)纖維素柱吸附和解吸附，即可得到較純的mRNA。

實驗材料

1、0.1mol/L NaOH （用0.1% DEPC處理過的無RNase水配置）

2、寡聚Oligo（dT）-纖維素

3、加樣/洗滌緩沖液1：0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每組250mL或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1% SDS。（用0.1% DEPC處理過的無RNase水配置）

4、洗滌緩沖液2：0.1 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每組250mL或10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 1mmol/L EDTA (pH8.0), 0.05% SDS。（用0.1% DEPC處理過的無RNase水配置）

5、5 mol/L NaCl（加0.1% DEPC處理過夜）

6、3 mol/L NaAc pH5.2（加0.1% DEPC處理過夜）

7、無RNase雙蒸水(DEPC水)

8、70%乙醇（用0.1% DEPC處理過的無RNase水配置）

需要用到的實驗儀器：恒溫水浴箱，高速冷凍離心機，紫外分光光度計，巴斯德吸管，玻璃棉，5ml一次性注射器。

實驗過程

（一） oligo(dT)纖維素的預處理

1、用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g oligo(dT)纖維素。

2、將懸浮液裝入填有經DEPC水處理，高壓滅菌后的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床約0.5-1.0mL，用3倍柱床體積的無RNase的滅菌雙蒸水沖洗oligo(dT)纖維素。

3、用3-5倍柱床洗滌緩沖液I沖洗oligo(dT)纖維素，直到流出液的pH值小于8.0。

4、將處理好的oligo(dT)纖維素從巴斯德吸管倒出，用適當的柱床洗滌緩沖液I懸浮，濃度約為0.1g/mL，保存在4℃待用。

（二） 總RNA濃度的調整

1、把總RNA液轉到適合的無RNase離心管中，測定總RNA的濃度。如果總RNA的濃度大于0.55mg/mL，則用無RNase的雙蒸水稀釋至0.55mg/mL，總RNA的濃度對除去rRNA是很重要的。濃度調整以后，把RNA溶液置于65℃水浴加熱5 min，然后迅速插在冰上冷卻。

2、加入一定體積5 mol/L NaCl使RNA溶液中鹽的濃度調至0.5 mol/L。