mRNA的分離和純化實驗（二）

（三） mRNA的分離

1、mRNA與Oligo(dT)-纖維素結合：用移液器重新懸浮oligo(dT)-纖維素，取適量的oligo(dT)-纖維素到RNA樣品中，蓋上蓋子，顛倒數次將oligo(dT)-纖維素與RNA混勻。于37℃水浴保溫并溫和搖蕩15min。oligo(dT)-纖維素與RNA所需量如下表。

表1 總RNA量所需材料的體積

2、轉移：取1個5ml注射器，用經過高溫滅菌的玻璃棉塞緊注射器前端，注射器固定在無RNase的支架上，把oligo(dT)-纖維素/RNA懸浮液加入注射器中，把塞子推到底部，收集流出的液體，即把含有未結合上的RNA液體收集到無RNase的離心管中（保留至確定獲得足夠的mRNA）。

3、洗滌：根據表1所需洗滌緩沖液1的體積，直接用注射器慢慢吸取，溫和振蕩，充分懸浮mRNA-oligo(dT)-纖維素，推動塞子，用無RNase的離心管收集洗出液。測定每一管的OD260，當洗出液中OD值為0時準備洗脫。

4、洗脫：根據表1所需洗脫液體積，用注射器慢慢吸取洗脫緩沖液2或無RNase雙蒸水到注射器內，充分重懸mRNA-oligo(dT)-纖維素，推動塞子，以1/3至1/2柱床體積分裝到無RNase的離心管中。

5、測定每一管的OD260，合并含有RNA的洗脫液。在4℃條件下，2500g，離心2-3min，將上清轉移至新無RNase的離心管中。

6、沉淀：向上清液中加入1/10體積的3mol/L NaAc （pH5.2）, 再加入2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻后，-20℃條件下沉淀30min或放置過夜。

7、離心收集：4℃條件下，12000g, 離心15min，小心棄去上清，用70%乙醇漂洗沉淀，4℃條件下，12000g, 離心5 min，小心棄去上清液。沉淀空氣干燥10min。將mRNA沉淀溶于適當體積的無RNase的雙蒸水，立即用于后續實驗，或用70%乙醇溶解，貯存于-70℃。

8、定量：測定OD260和OD280，計算產率以及OD260/OD280的比率

注意事項

1、整個操作過程必須嚴格遵守無RNase操作環境，且注意操作中的低溫要求。

2、用于純化的總RNA樣品須盡量保持RNA完整，不能被降解，獲得完整mRNA質量的前提條件。

3、總RNA與Oligo(dT)-纖維素的比例要適當，若總RNA會影響mRNA純度。

4、RNA溶液與Oligo(dT)-纖維素結合前必須置于65℃加熱5min，其作用：（1）破壞mRNA的二級結構，特別是poly(A+)尾處的二級結構，使poly(A+)尾充分暴露，提高poly(A+)RNA回收率；（2）解離mRNA與rRNA的結合。加熱后應立即插入冰上，以免由于溫度的緩慢下降使mRNA又恢復其二級結構。

5、應注意mRNA不能被DNA污染，否則嚴重影響實驗結果。

6、mRNA制備后，可用變性瓊脂糖凝膠電泳撿測其完整性和有無DNA污染。提取的mRNA應該在0.5~8.0kb之間呈現彌散狀，無明顯區帶，但大部分的mRNA應在1-2.0kb范圍內呈彌散狀。經過一次純化分離的mRNA還會有微量的rRNA殘留，但一般來說不會對后續實驗造成很大的影響，如果樣品純化后量足夠，可將經過一次純化分離的mRNA再純化一次，進一步提高其純度。

7、為防止mRNA降解，應避免多次凍融，可將mRNA少量分裝后保存。 也可將mRNA用70%乙醇溶解，在-70℃保存，保存時間在一年以上。

8、Oligo(dT)-纖維素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗凈，然后用層析柱加樣緩沖液平衡，并加入0.02%疊氮鈉（NaN3)，放在4℃冰箱保存。經過預處理后可以重復使用。