| 實驗材料 | mRNA 顯示蛋白翻譯反應產物 |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | Oligo 纖維素 Oligo（dT）結合緩沖液 Oligo 洗滌緩沖液 Ni-NTA 瓊脂糖 NI-NTA 結合緩沖液 Ni-NTA 洗脫緩沖液 鮭精 DNA BSA DNA splint Superscript Ⅱ 逆轉錄酶緩沖液 DTT 脫氧核苷三磷酸 Superscript Ⅱ 逆轉錄酶 脫氧核苷三磷酸溶液 ATP-適配體篩選結合緩沖液 ATP-適配體篩選洗脫緩沖液 |
| 儀器、耗材 | 層析柱 凝膠過濾柱 |
| 實驗步驟 |
實驗所需「材料」、「試劑」、「耗材」具體見「其他」 1. 在層析柱中用去離子水反復洗滌 20 mg oligo （dT） 纖維素。重懸纖維素若干次并用正向壓力迫使液體快速流出。最后，用 oligo （dT） 結合緩沖液洗滌一次。 2. 用 oligo （dT） 結合緩沖液將加有 KCl 和 MgCl2 的 1.3 ml 含 mRNA 顯示蛋白的翻譯反應產物稀釋到 8.7 ml。然后與洗滌過的 oligo （dT） 纖維素一起在 4℃ 旋轉孵育 15 min。 3. 使稀釋的翻譯反應混合物和 oligo （dT） 纖維素流過層析柱，oligo （dT） 纖維素留在過濾器板上，保留流出液。 4. 用 1 ml oligo （dT） 結合緩沖液洗滌 3 次。 5. 用 1 ml oligo （dT） 洗滌緩沖液洗滌 1 次。 6. 用 0.5 ml 去離子水洗脫 3 次。 7. 用 Tris-tricine SDS-PAGE 和閃爍計數法分析未稀釋的翻譯反應混合物、流出液以及所有的洗滌液和洗脫液。 8. 用下列算式計算翻譯反應混合物中 mRNA 顯示蛋白的濃度： ［mRNA 顯示蛋白］＝ Y-1×C×［甲硫氨酸］×N-1 此處，Y 是經 SDS-PAGE 測定的 oligo （dT） 纖維素純化的產量；C 是由閃爍計數測定的 oligo （dT） 洗脫組分合并后的計數值除以等份的翻譯反應混合物的計數值；［甲硫氨酸］ 是指高鹽孵育前翻譯反應混合物中放射性與非放射性甲硫氨酸的總濃度；N 是指在單個顯示蛋白中甲硫氨酸的平均數目。 Ni-NTA 純化是基于 His6 標簽，僅適用于庫的序列中存在該標簽的情況下。 9. 用 1 ml 去離子水洗滌 100 ul Ni-NTA 瓊脂糖 3 次。 19. 將 0.5 ml oligo （dT） 洗脫液與 2×Ni-NTA 結合緩沖液混合，渦旋振蕩以溶解， 加入 0.7 ul 2-巰基乙醇，4℃ 下與洗過的 Ni-NTA 瓊脂糖旋轉孵育 1 h。 11. 使 Ni-NTA 結合緩沖液和 Ni-NTA 瓊脂糖流過層析柱，Ni-NTA 瓊脂糖保留在過濾器板上，保留流出液。 12. 于層析柱上進行下列洗滌： a. 用 500 ul Ni-NTA 洗滌緩沖液 1 洗滌兩次。 b. 用 500 ul 4：1 的 Ni-NTA 洗滌緩沖液 1/Ni-NTA 洗滌緩沖液 2 洗滌一次。 c. 用 500 ul 3：2 的 Ni-NTA 洗滌緩沖液 1/Ni-NTA 洗滌緩沖液 2 洗滌一次。 d. 用 500 ul 2：3 的 Ni-NTA 洗滌緩沖液 1/Ni-NTA 洗滌緩沖液 2 洗滌一次。 e. 用 500 ul 1：4 的 Ni-NTA 洗滌緩沖液 1/Ni-NTA 洗滌緩沖液 2 洗滌一次。 f. 用 500 ul Ni-NTA 洗滌緩沖液 2 洗滌一次。 g. 用 500 ul 19 ： 1 的 Ni-NTA 洗滌緩沖液 2/Ni-NTA 洗脫緩沖液洗滌兩次。 h. 4℃ 下用 250 ul Ni-NTA 洗脫緩沖液旋轉洗脫 30 min， 洗脫兩次。 洗脫液中應加入 EDTA 到 5 mmol/L 以結合被洗脫的 Ni2＋。 13. 用 Tris-tridne SDS-PAGE 和閃爍計數法分析起始材料、流出液以及所有的洗滌液和洗脫液。 在 Ni-NTA 結合和洗滌緩沖液中應避免使用強的螯合劑如 EDTA、EGTA 和 DTT， 因為這些試劑能與固相的 NTA 競爭結合 Ni2＋，因而能將之從瓊脂糖上洗脫下來。 14. 用 10 ml 去離子水流過 NAP-5 凝膠過濾柱將洗脫緩沖液置換成水。 15. 將 100 ul 10 mg/ml 鮭精 DNA 與 10 ul 1 mg/ml BSA 加入 890 ul 去離子水中，渦旋振蕩，然后使此溶液流過凝膠過濾柱。 16. 使 10 ml 去離子水流過凝膠過濾柱。 17. 使 0.5 ml 樣品流過凝膠過濾柱。 18. 往柱中加入 1 ml 去離子水，從柱底收集 1 ml 洗脫液。 19. 用 Tris-tricine SDS-PAGE 和閃爍計數法分析起始材料和洗脫組分。 29. 留出一小份 mRNA 顯示蛋白樣品不進行逆轉錄以用作非 RT 對照的 PCR 擴增。 21. 于冰上配制下列逆轉錄反應混合物。在加入 RT 緩沖液前，先將 mRNA 顯示蛋白與 DNA splint （作為 RT 引物）混合，最后加入逆轉錄酶： 900 ul mRNA 顯示蛋白 15 ul 200 umol/L DNA splint （最終為 2umol/L） 300 ul 5× 逆轉錄緩沖液（最終為 1×） 150 ul 100 mmol/L DTT （最終為 10 mmol/L） 30 ul 25 mmol/L （每個）脫氧核苷三磷酸（最終為 0.5 mmol/L） 5 ul 水 10 ul 200 U/ul SuperscriptⅡ 逆轉錄酶（最終為 1333 U/ml） 總體積 1500 ul 逆轉錄反應于 42℃ 孵育 50 min。 22. 用Tris-tricine SDS-PAGE 和閃爍計數法分析起始材料和逆轉錄產物。 除非在篩選實驗前先將 mRNA 顯示模板進行逆轉錄，在篩選實驗中使用 mRNA 顯示蛋白可以獲得有功能的 RNA 序列。這還會減少 mRNA 顯示模板干擾所顯示蛋白的結構的可能性。最初用 mRNA 顯示篩選出的蛋白質可能需要在逆轉錄條件下進行孵育以使其形成有活性的構象。 23. 參照廠家的說明用 NAP-5 凝膠過濾柱將緩沖液置換成篩選緩沖液。 24. 使 10 ml 篩選結合緩沖液流過凝膠過濾柱。 25. 將 100 ul 10 mg/ml 鮭精 DNA 與 10 1 mg/ml BSA 加入 890 ul 篩選結合緩沖液中，渦旋振蕩，然后使此溶液流過凝膠過濾柱。 26. 使 10 ml 篩選結合緩沖液流過柱子，并使 0.5 ml 樣品流過凝膠過濾柱。 27. 加入 1 ml 篩選結合緩沖液到凝膠過濾柱的頂端，然后收集 1 ml 柱底流出的洗脫液。 28. 用Tris-tricine SDS-PAGE 和閃爍計數法分析起始材料和洗脫組分。 表1 mRNA 顯示蛋白的翻譯反應
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| 注意事項 | |
| 其他 |
1. 材料 1.3 ml mRNA 顯示蛋白翻譯反應產物 2. 試劑 Oligo（dT）纖維素（Amersham Pharmacia Biotech） Oligo（dT）結合緩沖液 Oligo（dT）洗滌緩沖液 Ni-NTA 瓊脂糖（Qiagen） NI-NTA 結合緩沖液 2-巰基乙醇 Ni-NTA 洗滌緩沖液 1 Ni-NTA 洗滌緩沖液 2 Ni-NTA 洗脫緩沖液 10 mg/ml 鮭精 DNA （Life Technologies） 1 mg/ml BSA 200 umol/L DNA splint 5× Superscript Ⅱ 逆轉錄酶緩沖液（NEB） 0.1 mol/L DTT 30 ul 25 mmol/L（每個）脫氧核苷三磷酸（最終為 0.5 mmol/L） 200 U/ml Superscript Ⅱ 逆轉錄酶（NEB） 25 mmol/L 脫氧核苷三磷酸溶液 ATP-適配體篩選結合緩沖液 ATP-適配體篩選洗脫緩沖液 3. 耗材 層析柱（Bio-Rad） 凝膠過濾柱（如 NAP-5，Amersham Pharmacia Biotech）
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