mRNA3＇末端體外加工

對數生長期的 HcLa 細胞 與所使用啟動子相對的 RNA 聚合酶 酵母 tRNA 經超盧斷裂鮭精 DNA S1 核酸酶 KlenowDNA 聚合酶

MWCO3500(1 ml cm) 透析袋 Dounce 勻漿器   Gorrex 離心管 15 mlFalcon 或 Corning 離心管 Econo 層析柱 X 射線膠片及曝光盒

―、材料與設備

(一）核提取物制備

1) 對數生長期的 HcLa 細胞。

2)PBS：0.2 g/LKCl ，0.2 g/L KH2P04, 8.0 g/LNaCl2.，16 g/L Na₂ HPO₄.7 H₂0

以下緩沖液 A、C、D 儲存于 4℃，DTT 配成 1mol/L 儲存溶液，現用現稀釋。

3) 緩沖液 A:10 mmol/LHEPES，4℃ 時 pH7.9, 10 mmol/LKCl, 1.5 mmol/L MgCl₂.  0.5 mmol/LDTT。

4) 緩沖液 C:20 mmol/LHEPES，4℃ 時 pH7.9,420 mmol/LNaCl，0.2 mmol/LEDTA,25% 甘油（USP 級），1.5 mmol/LMgCL2，0.5 mmol/LDTT。

5) 緩沖液 D:20 mmol/L,HEPES，4℃ 時 pH7.9  .l00 mmol/LKC1, 0.2 mmo1/L EDTA,  20% 甘油，0.5 mmol/LDTT。

6)MWCO  3500(1 ml/cm) 透析袋（Spectropre)

7)0.04% 臺盼藍

8)Dounce 勻漿器

9)Gorrex 離心管

10）15 mlFalcon 或 Corning 離心管。

(二) 前 mRNA 制備

1) 反應緩沖液：40 mmol/LTris-HCl(pH8.0)，25 mmol/LNaCl, 8 mmol/LMgCl₂,  2 mmol/L 精脒

2)280 mmol/L 帽類似物 (m＇G[5＇]ppp[5＇]G，Pharmacia.Picataway，NJ,USA)。

3〕1moL/LDTT。

4)1Ommol/LGTP

5)100 mmol/LUTP、ATP,CTP 溶液

6)[5 H]CTP,30-60Ci/mmol

7) 與所使用啟動子相對；的 RNA 聚合酶。

8) 無 RMase 的 DNase

(三）體外加工

1)50 mmol/LMgCl₂

2)10% 聚乙烯醇。

3)0.5mol/L 磷酸肌酸。

4)10 mmol/L 四種 GTP、ATP、UTF、CTP

5)25 mmol/LATP

6) 終出緩沖液：50 mmol/LTris-HCl（pH7.4）50 mmol/LEDTA,  O.l%SDS

7) 蛋白酶 K

S)10 mmol/LTris-HCl(pH7,4),10 mmoL/LEDTA 飽和酚

9) 氯仿：異戊醇（24:1)

10)1.5mol/LNH4Ac

11)10 mg/ml 酵母 tRNA

12) 乙醇

(四）寡聚 dT 纖維素層析

1)5mol/LNaCL

2) 寡聚 dT 纖維素。

3)TE：10 mmol/LTris-HCl(PH7.4), lmmol/L EDTA

4) 結合緩沖液：TE 十 0.5mol/LNaCl

5) 洗滌緩沖液：TE+0.1mol/LNaCl

6)3mol./LNaAc

7)Econo 層析柱（Bio-Rad,Hercules,CA,USA) 或其他一次件層析裝置。

(五）S1 核酸酶分析

1)S1 雜交緩沖液：80% 離子超純甲酰胺，lOmmol/LPIPES(pH6.1)，0.4mol/LNaCl

2)10mol/ml 經超盧斷裂鮭精 DNA。

3)5XS1 消化緩沖液:0.15mol/LNaAc(pH4.5），2mol/LNaCl，5 mmol/LZnSO₄

4)S1 核酸酶。

5)40% 丙烯酰胺溶液（丙烯酰胺：業甲雙內烯酰胺 19:1）

S) 凝膠上樣緩沖液：80% 去離子甲酰胺，0.1% 溴酚藍，0.1% 二甲苯藍，lOmmol/LNaOH，1XTBE

7)10XTBE:108 g/LTris 堿，55 g/L 硼酸，9.3 g/LNa₂EDTA。

8)X 射線膠片及曝光盒，結果需要定暈的話，則需顯像密度計或其他定量測定設備。

9)[32P]dNTPT 3000Ci/mmol, 使用的 dNTP 由探針的序列決定。

1⑴Klenow nDNA 聚合酶

二、操作方法

(1) 核提取物制備

核提取物的制備通常使用 HeLa 細胞，其他細胞系也可以. 制備有效核提取物最關鍵是在對數生長期收獲細胞, 在低溫下操作，時間越短越好。一般可采用轉瓶培養細胞，這樣可以獲取人最的提取物，下面所述的操怍方法同樣適用于貼壁培養的細胞。

1) 用物理方法或胰酶消化法收荻細胞，于 4℃ 200 g 離心然后用預冷的滅菌 PBS 洗細胞 3 次。

2) 用 5 倍體積緩沖液 A(注意加入 DTT) 重懸細胞注意該步驟及隨后的操作都應在低溫下逬行)。細胞充分懸浮后在冰上放置 10 min，將細胞轉移至預冷的滅菌 Correx 管屮，于 4℃600 g 離心 1Omin. 此時沉淀的細胞體積應該發生膨脹，去除上清，加入 2 倍體積緩沖液 A, 充分懸浮細胞。

3）將混勻的細胞轉移到預冷 Dounce 勻漿器，勻漿約 15 次，取少量樣品與等量臺盼藍混合以判定細胞裂解情況，在顯微鏡下觀察. 裂解的細胞屮的細胞核能夠攝取染料變成藍色，而完整的細胞則無色。必須保證超過 90% 的細胞裂解，將裂解后的細胞轉入預冷的滅菌 Correx 管中，于 4℃1500 g 離心 lOmin, 收集細胞核。

4) 細胞核離心后，去除上淸，對應起始的細胞量，在每 IX109 個細胞中加入 3 ml 緩沖液 C，緩沖液 C 的加入量作常關鍵。

5) 將沉淀充分混懸后，將核轉如勻漿器，勻漿 15 次，樣將核轉入預冷滅菌的 Falcon 離心管，4°C 于旋轉儀上輕輕混勻 lh。

6) 用蒸餾水清洗透析袋，然后浸放在蒸餾水中。同時在滅菌的 2L 燒杯中加入 1L 緩沖液 D(注意加入 DTT)，同時放胃一滅菌攪拌子，置于 4℃。

7) 提取步驟完成后，將含存核的溶液轉入預冷滅菌 Correx 管，于 4°C10000 g 離心 30 min. 將上淸轉入透析袋并央緊, 將透析袋置于緩沖液 D 中，在冷室屮透析 2-2.5 h，之后將樣品分裝到干冰冰上的微量離心管中，立即置于一 70°C 保存。采用常規方法測定蛋白濃度。

(二) 采用噬菌體 RNA 聚合酶合成前 mRNA

制備前 mRNA 的質粒含冇能被噬菌體 T7、T3、SP6 等 RNA 聚合酶識別的啟動 T 和編碼 poly(A)+位點，用限制性內切核酸酶在 3'端加上信號下游處切開質粒從而形成線狀 DNA, 用酚和氯仿抽提，乙醇沉淀進行純化，之后用于轉錄反應。合成 RNA 時使用的 [32P]UTP 可直接檢測轉珙產物；如果不用 [³²P] 標記的核苷酸，則可利用 [32P」標記的 S1 探針進行檢測。下面的法是利用 [3 H] 示蹤標記制備前 mRNA，其后加工可以采用 S1 核酸酶分析來進行測定。

1) 在含有 40 mmol/LTris(pH8.0)，25 mmol/LNaCl,  2 mmol/LMgCl₂, 2 mmol/L 精脒，2.8 mmol/L 帽類似物，5 mmol/LDTT，5uCi[3 H]UTP,100mol/LGTF,lmmol/LATP、UTP 和 CTP 的叫反應體系屮加入 2ug 線狀 DNA 模板和 T7RNA 聚合酶，18℃ 孵育最后加入 2U 無 RNase 的 DNase，于 37℃ 孵育 15 min, 以終止反應.

2) 根據 TCA 沉淀物屮 UTp 摻入量可以確定 RNA 的產量, 該前 mRNA 的加工可利用 3＇端標記的 DNA 探針雜交測定，因此沒有必要純化全長分子。

(三）前 mRNA 加工反應

1) 在含有 2 mmol/LMgCl₂,3% 聚乙烯醇，20 mmol/L 磷酸肌酸 ATP,lOOug 核提取物的 50ul 反應體系中加入 2nmol/L(l00fmol) 前 mRNA(每次制備的核提取物的量都需要測定，100ug 通常足夠; 前 mRNA 的量也應測定，比較理想的用量為 1-10nmmol/L)

2)30℃ 孵育 2 h

3) 加入等量的終止緩沖液和 30ug 蛋內酶 K,37℃ 孵 15 min, 以終止反應。用酚，氯仿/異戊醇各抽提一次，再加入乙酸銨，25ug 酵母 tRNA 和 2 倍體積乙醇來沉淀 RNA。

4) 當使用 [³²P] 標記的 RNA 時，貞接利用凝膠電泳測定產物，如果使用 [3 H]UTP 標記 RNA，在 S1 分析之前需用寡聚 dT 纖維素層析純化 RNA 產物

(四）轉錄加工反應

1)501ul 反應體系中，將 1ug 超螺旋 DNA 底物與 100ug 核提取物，3.0% 聚乙烯醇，20 mmol/L 磷酸肌酸,2 mmol/LMgCl₂,600 mmol/L 每種 GTF.ATP，UTP 和 CTP,30℃ 孵育 2 h

2) 加入等量的終止緩沖液和 30ug 蛋白酶 K，37℃ 孵育后終止反應。用酚、氯仿/異戊醇各抽提一次，再加入 2.5mol/L 乙酸銨，25ug 酵母 tRNA 和 2 倍體積乙醇來沉淀 RNA，用寡聚 dT 纖維素柱分離純化 Poly(A)+RNA

(五）寡聚 dT 纖維素柱層析

1) 填裝 0.lml 柱床體枳的寡聚 dT 纖維素柱，用 5 倍柱床體積的結合緩沖液平衡層析柱。

2) 將 RNA 溶于 TE, 加熱至 60℃ 變性 5 min 后置于冰上，然后在體系屮加入 NaCl 至終濃度為 0.5mol/L, 以防止 RNA 復性，將 RNA 樣品上柱，收集流出液體，再重新上柱。

3）用 5 倍體積的結合緩沖液洗杵，收集流出部分，加上上樣過程中的流出部分. 即為 Poly(A)+部分，可以丟棄或備用。

4) 用 3 倍體積的含 0.1moL/LNaCL 的 TE 洗柱，棄去洗脫液。

5) 用 3 倍體積 TE 洗脫 Poly(A)+RNA，收集洗脫液

6) 用終濃度 0.3mol/LNaAc 和 2 倍體積乙醇沉淀 RNA。

(六）S1 核酸酶分析加工后的 RNA

1) 用形成突出端的限制件內切核酸酶在多聚 A 位點的上游切開質粒后將其作為 S1 分析的 DNA 探針。用 KlenowDNA 聚合酶和相應的 [32P]dNTP 補平末端，在補平反應前純化 DNA，但對于大多數酶切反應，可以在酶切完全后直接加入 50-lOOuCi[a^-32P] 放射性標的核甘酸（3000Ci/mmol) 和 1UKlenow 酶，在冰上孵育 30 min。標記反應后，用酚和氯仿抽提 DNA，柯用乙醇沉淀，用第二種酶在多聚 A 位點下游切割，利用常規的膠純化標記的片段。

2) 將沉淀探針和 RNA 溶于 150ulS1 雜交緩沖液中，探針的用量必須根據經驗來判足以保證探針的董在反應中超過產物的量。于 90-95℃ 加熱混合物然后迅速將管浸入合適溫度的水浴中，此時操作必須迅速，確保溫度始終不能低于雜交溫度，雜交過夜。

3) 制備下列混合物，置于冰上：100ul5×S1 梭酸酶消化緩沖液，35ul 重蒸水，10ug 新變性 (煮 5 min) 的超聲打斷的鮭魚精 DNA，250US1 核酸酶（此 S1 核酸酶量通常足以完成反應，但應根據經驗進行適當調整），在消化開始前，小心打開含有雜交混合物的反應管，反應管始終置于冰上，將 150ul 冰預冷的消化混合物加入反應管中，立即從水浴中取出反應管，加蓋，顛倒數次以混勻，再置于冰上。直到所有反應管處理完畢，然后快速短暫離心，再次將反應管移入加 20-25℃ 水浴中進行消化。如果雜交序列 AT 含量較高，溫度也可稍低一些，消化通常在 1-2 h 內完成，但對于不同的探針成根據經驗怍出適當調整。

(七）反應產物電泳分析

用聚丙烯酰胺尿素測序膠分離標記的 RNA 或通過 S1 核酸酶分析所得的產物，當使用同位素標記的 RNA 吋，在凝膠上會出現上樣 RNA 形成的條帶以及遷移較慢的梯帶，這些梯帶即適被切割以及多聚腺苷酸化的產物，形成梯帶是因為 poly(A)+尾長度不一。如果抑制 RNA 加 pdy(A）+尾反應，則在凝膠上. 能觀察到 5＇端切除產物的遷移比加入的 RNA 要快。在 S1 核酸酶分析過程中. 出于切割的 RNA 的保護作用，可以發現未消化的探針以及消化產物。

1) 寡聚 dT 纖維素的再生：先用水沖洗，再用 0.lmol/LNaOH 和 5 mmol/LEDTA 洗, 最后再用水洗，徹底沖洗去除 NaOH（pH 試紙測定 pH)。寡聚 dT 纖維素一般可用 3 次.

2) 如果不用 RNase 抑制劑（如 DEPC) 處理 RNA, 只要在操作中仔細的話，高壓滅菌通常能起作用。另外操作 RNA 的移液器攝好專用

3) 制備細胞活性提取物的關鍵是細胞生長狀態要好，并且操作一定要迅速，

4) 進行 S1 核酸酶分析時有兩步非常關鍵，在任何時候都要保證雜交混合物的溫度不要低于雜交溫度。這兩步為：一是將反應管從變性步驟轉至雜交水浴時動作一定要迅速；二是向反應屮加入消化混合物時，反應管必須仍責于雜交水浴中. 最佳的雜交溫度下產生的信號干凈，背景低。對于大多數探針，55-60℃ 比較合適，但有些探針的雜交溫度則需要裉據具體情形作適當調整。

5) 若僅僅只測試前 RNA 的切割，則在反應體系中加入 0.5 mmol/L3＇ATP，在提取物中 pdy(A)+聚合酶的作用下，將其摻入切割部位，并引起鏈終止。