利用Ion半導體測序開展基因表達譜分析

     新一代測序技術的出現改變了基因表達譜分析和轉錄組研究。在其他方法還依賴預知信息進行雜交探針或qPCR引物設計時，RNA-Seq技術可直接對測序文庫中任一RNA分子進行無假設的分析。RNA-Seq技術不單能測定轉錄本數，研究表達水平差異 [1]，還能檢測序列特異的信息，如轉錄本的起始和終止位點[2]、SNV [3]，和RNA編輯事件[4]。RNA-Seq技術還具有一些其他優勢，包括更高的靈敏度、更廣的動態范圍，以及評估融合轉錄本和變異表達水平的能力。

         Ion PGM?測序儀推動了RNA-Seq技術的普及。結合Ion Total RNA-Seq Kit v2[5]和Ambion ERCC Spike-In Control提供的額外質量控制[6]，Ion半導體測序生成數據的靈敏度超過了傳統微陣列芯片。Ion半導體測序能夠在單次實驗中對新轉錄本、基因融合和等位基因特異表達同時進行檢測。Ion PGM?測序儀配有多種產量不同的芯片組合，適合多種轉錄組大小并能擴展到不同的RNA測序應用。Ion半導體測序提供zui快的測序流程，100 base讀取的測序運行時間只需約2小時，數據分析直觀簡便數據分析直觀簡便（可使用公共軟件）。

         那么，究竟Ion PGM?測序儀生成多少個100 base讀取能相當于一個基因表達微陣列芯片呢？在白皮書[9]中我們對Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Arrays （HG-U133 Plus 2.0）的芯片質量控制（MAQC）的微陣列數據與Ion PGM?系統生成的RNA-Seq數據進行了比較。圖1顯示了Ion PGM?測序儀數據按照不同檢測閾值下所得的基因數和微陣列芯片所能檢測到的基因數。當采用zui嚴謹的檢測閾值即每個基因≥10讀取時，兩百萬個來自Ion PGM?測序儀的已定位讀取所能檢測到的基因數超過了微陣列芯片能檢測的基因。當讀取計數閾值放寬到≥5讀段數/基因時，僅僅1百萬個Ion RNA-Seq已定位讀取所能檢測到的基因數就超過了芯片的基因檢測數。利用來自Ion PGM?測序儀的2百萬個平均讀取所能檢測到的顯著差異表達基因數（sig DEGs）要多于微陣列芯片所能檢測到的sig DEGs數。在p ≤0.05和倍數變化f≥2標準下，在HBRR和UHRR樣本中Ion PGM?測序儀得到的sig DEGs數為4,630，而相比之下芯片得到的sig DEGs數為4,198。

        可擴展的技術：RNA-Seq的一個獨特優勢在于，通過生成的讀取數目，可以輕而易舉地調節實驗靈敏度。Ion PGM?測序儀的配套芯片組合和新RNA barcodes（Ion Xpress? RNA-Seq Barcode01-16試劑盒）讓研究者能根據實驗需要選擇讀取數目。具有6百萬微孔的Ion 316? 芯片適用于小型轉錄組研究。而超過一千一百萬微孔的Ion 318?芯片能生成超過兩百萬定位RefSeq exons的讀取[10]，如上所述其靈敏度超越了HG-U133 Plus 2.0 array。隨著Ion半導體測序技術的持續快速發展，轉錄組分析能力和方法也將隨之改進。例如，經過優化的Dynabeads mRNA DIRECT? Micro試劑盒在從總RNA抽提mRNA時，能進一步減少產物中的rRNA含量，增加定位于RefSeq的讀取數。如圖6所示，使用這個僅耗時30分鐘的從總RNA中純化poly（A） RNA的方法，定位于rRNA的讀取數顯著降低，而相應增加了定位于RefSeq exons的讀取數。