生化實驗講義(理論部分)四－－電泳技術（二）

4.9 梯度凝膠電泳

梯度凝膠電泳也通常采用聚丙烯酰胺凝膠，但不是在單一濃度(孔徑)的凝膠上進行，而是形成梯度凝膠。從凝膠頂部到底部丙烯酰胺的濃度呈梯度變化，如通常頂部凝膠濃度為5%，底部凝膠濃度為25%。凝膠梯度是通過梯度混合器形成的，高濃度的丙烯酰胺溶液首先加入到玻璃平板中，而后溶液濃度呈梯度下降，因此在凝膠的頂部孔徑較大，而在凝膠的底部孔徑較小。梯度凝膠電泳也通常加入SDS，并有濃縮膠。電泳過程與SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳基本類似。與單一濃度的凝膠相比，梯度凝膠有幾個優點：①首先，梯度凝膠比單一濃度凝膠的分離范圍更寬，可以同時分離較大范圍分子量的蛋白質。單一凝膠電泳對于分子量超過其分離范圍的蛋白質，過大或過小，都不能分離。而梯度凝膠孔徑范圍比單一凝膠大，分子量較大的蛋白質可以在凝膠頂部大孔徑部分得到分離，而分子量較小的蛋白質可以在凝膠底部小孔徑部分得到分離，所以分子量較大和較小的蛋白質可以同時得到分離。例如用4%～30%的梯度膠可以分離分子量5萬～200萬的蛋白質。② 另一個優點是梯度凝膠可以分辨分子量相差較小，在單一濃度凝膠中不能分辨的蛋白質。電泳過程中，蛋白質在梯度凝膠中遷移，經過的孔徑越來越小，直到凝膠的孔徑不能通透，這樣電泳過程中蛋白質就被濃縮，集中在一個很窄的區帶中。而分子量略小的蛋白質可以遷移得更靠前一些，被集中在略前面的區帶中。由于梯度凝膠孔徑逐步變小，在蛋白質不能通透的孔徑附近對蛋白有濃縮作用，所以電泳后形成很窄的區帶，可以分辨出分子量相差較小的蛋白質。對于太稀的樣品，在電泳過程中可以將樣品分幾次加樣，大小不同的蛋白質分子最終都會滯留在其相應的凝膠孔徑中而得到分離。③ 可以直接測定天然狀態蛋白質的分子量而不需要解離為亞基，因此這一方法可以與SDS-PAGE測定分子量的方法互為補充。

梯度凝膠電泳主要適用于測定球蛋白的分子量，而對纖維蛋白將產生較大的誤差。由于分子量的測定必須是在未知和標準蛋白質分子到達完全被阻止遷移的孔徑時才能成立，因此電泳時要使用較高的電壓，例如平板凝膠為0.5mm厚，使用600V電壓， 50mA電流，電泳時間約需2小時。

4.10 等電聚焦

等電聚焦電泳是根據兩性物質等電點(pI)的不同而進行分離的，它具有很高的分辨率，可以分辨出等電點相差0.01的蛋白質，是分離兩性物質如蛋白質的一種理想方法。等電聚焦的分離原理是在凝膠中通過加入兩性電解質形成一個pH梯度，兩性物質在電泳過程中會被集中在與其等電點相等的pH區域內，從而得到分離。

兩性電解質是人工合成的一種復雜的多氨基-多羧基的混合物。不同的兩性電解質有不同的pH梯度范圍，既有較寬的范圍如pH=3～10，也有各種較窄的范圍如pH=7～8。要根據待分離樣品的情況選擇適當的兩性電解質，使待分離樣品中各個組分都在兩性電解質的pH范圍內，兩性電解質的pH范圍越小，分辨率越高。

等電聚焦多采用水平平板電泳，也使用管式電泳。由于兩性電解質的價格昂貴，使用1～2 mm厚的凝膠進行等電聚焦價格較高。使用兩條很薄的膠帶做為玻璃板間隔，可以形成厚度僅0.15 mm的薄層凝膠，大大降低成本，所以等電聚焦通常使用這種薄層凝膠。由于等電聚焦過程需要蛋白質根據其電荷性質在電場中自由遷移，通常使用較低濃度的聚丙烯酰胺凝膠(如4%)以防止分子篩作用，也經常使用瓊脂糖，尤其是對于分子量很大的蛋白質。制作等電聚焦薄層凝膠時，首先將兩性電解質、核黃素與丙烯酰胺貯液混合，加入到帶有間隔膠條的玻璃板上，而后在上面加上另一塊玻璃板，形成平板薄層凝膠。經過光照聚合后，將一塊玻璃板橇開移去，將一小薄片濕濾紙分別置于凝膠兩側，連接凝膠和電極液(陽極為酸性如磷酸溶液，陰極為堿性如氫氧化鈉溶液)。接通電源，兩性電解質中不同的等電點的物質通過電泳在凝膠中形成pH梯度，從陽極側到陰極側pH值由低到高呈線性梯度分布。而后關閉電源，上樣時取一小塊濾紙吸附樣品后放置在凝膠上，通電30 min后樣品通過電泳離開濾紙加入凝膠中，這時可以去掉濾紙。最初樣品中蛋白質所帶的電荷取決于放置樣品處凝膠的pH值，等電點在pH值以上的蛋白質帶正電，在電場的作用下向陰極移動，在遷移過程中，蛋白質所處的凝膠的pH值逐漸升高，蛋白質所帶的正電逐漸減少，到達pH=pI處的凝膠區域時蛋白質不帶電荷，停止遷移。同樣，等電點在上樣處凝膠pH以下的蛋白質帶負電，向陽極移動，最終到達pH=pI處的凝膠區域停止。可見等電聚焦過程無論樣品加在凝膠上什么位置，各種蛋白質都能向著其等電點處移動，并最終到達其等電點處，對最后的電泳結果沒有影響。所以有時樣品可以在制膠前直接加入到凝膠溶液中。使用較高的電壓(如2000V，0.5mm平板凝膠)可以得到較快速的分離(0.5～1小時)，但應注意對凝膠的冷卻以及使用恒定功率的電源。凝膠結束后對蛋白質進行染色時應注意，由于兩性電解質也會被染色，使整個凝膠都被染色。所以等電聚焦的凝膠不能直接染色，要首先經過10%的三氯乙酸的浸泡以除去兩性電解質后才能進行染色。

等電聚焦還可以用于測定某個未知蛋白質的等電點，將一系列已知等電點的標準蛋白(通常pI在3.5～10之間)及待測蛋白同時進行等電聚焦。測定各個標準蛋白電泳區帶到凝膠某一側邊緣的距離對各自的pI值作圖，即得到標準曲線。而后測定待測蛋白的距離，通過標準曲線即可求出其等電點。

等電聚焦具有很高的靈敏度，特別適合于研究蛋白質微觀不均一性，例如一種蛋白質在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中表現單一帶，而在等電聚焦中表現三條帶。這可能是由于蛋白質存在單磷酸化、雙磷酸化和三磷酸化形式。由于幾個磷酸基團不會對蛋白質的分子量產生明顯的影響，因此在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中表現單一帶，但由于它們所帶的電荷有差異，所以在等電聚焦中可以被分離檢測到。同功酶之間可能只有一兩個氨基酸的差別，利用等電聚焦也可以得到較好的分離效果。由于等電聚焦過程中蛋白質通常是處于天然狀態的，所以可以通過前面介紹的活性染色的方法對酶進行檢測。等電聚焦主要用于分離分析，但也可以用于純化制備。雖然成本較高，但操作簡單、純化效率很高。除了通常的方法，制備性等電聚焦也可以在垂直玻璃管中的梯度蔗糖溶液或顆粒狀凝膠如Sephadex G-75中進行。

4.11 二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D―PAGE)

二維聚丙烯酰胺凝膠電泳技術結合了等電聚焦技術(根據蛋白質等電點進行分離)以及SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(根據蛋白質的大小進行分離)。這兩項技術結合形成的二維電泳是分離分析蛋白質最有效的一種電泳手段。通常第一維電泳是等電聚焦，在細管中(φ1～3 mm)中加入含有兩性電解質、8M的脲以及非離子型去污劑的聚丙烯酰胺凝膠進行等電聚焦，變性的蛋白質根據其等電點的不同進行分離。而后將凝膠從管中取出，用含有SDS的緩沖液處理30 min，使SDS與蛋白質充分結合。將處理過的凝膠條放在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠上，加入丙烯酰胺溶液或熔化的瓊脂糖溶液使其固定并與濃縮膠連接。在第二維電泳過程中，結合SDS的蛋白質從等電聚焦凝膠中進入SDS-聚丙烯酰胺凝膠，在濃縮膠中被濃縮，在分離膠中依據其分子量大小被分離。這樣各個蛋白質根據等電點和分子量的不同而被分離、分布在二維圖譜上。細胞提取液的二維電泳可以分辨出1000～2000個蛋白質，有些報道可以分辨出5000～10000個斑點，這與細胞中可能存在的蛋白質數量接近。由于二維電泳具有很高的分辨率，它可以直接從細胞提取液中檢測某個蛋白。例如將某個蛋白質的mRNA轉入到青蛙的卵母細胞中，通過對轉入和未轉入細胞的提取液的二維電泳圖譜的比較，轉入mRNA的細胞提取液的二維電泳圖譜中應存在一個特殊的蛋白質斑點，這樣就可以直接檢測mRNA的翻譯結果。二維電泳是一項很需要技術并且很辛苦的工作。目前已有一些計算機控制的系統可以直接記錄并比較復雜的二維電泳圖譜。

4.12 蛋白質的檢測、鑒定及回收

檢測蛋白質最常用的染色劑是考馬斯亮藍R-250(CBB，Coomassie brilliant blue)，通常是用甲醇：水：冰醋酸(體積比為45：45：10)配制0.1%或0.25%(W/V)的考馬斯亮藍溶液作為染色液。這種酸-甲醇溶液使蛋白質變性，固定在凝膠中，防止蛋白質在染色過程中在凝膠內擴散，通常染色需2小時。脫色液是同樣的酸-甲醇混合物，但不含染色劑，脫色通常需過夜搖晃進行。考馬斯亮藍染色具有很高的靈敏度，在聚丙烯酰胺凝膠中可以檢測到0.1 ?g的蛋白質形成的染色帶。考馬斯亮藍與某些紙介質結合非常緊密，所以不能用于染色濾紙、醋酸纖維素薄膜以及蛋白質印跡(在硝化纖維素紙上)。在這種情況下通常是用10%的三氯乙酸浸泡使蛋白質變性，而后使用不對介質有強烈染色的染料如溴酚藍、氨基黑等對蛋白質進行染色。

銀染是比考馬斯亮藍染色更靈敏的一種方法，它是通過銀離子(Ag+)在蛋白質上被還原成金屬銀形成黑色來指示蛋白區帶的。銀染可以直接進行也可以在考馬斯亮藍染色后進行，這樣凝膠主要的蛋白帶可以通過考馬斯亮藍染色分辨，而細小的考馬斯亮藍染色檢測不到的蛋白帶由銀染檢測。銀染的靈敏度比考馬斯亮藍染色高100倍，可以檢測低于1 ng的蛋白質。

糖蛋白通常使用過碘酸-Schiff試劑(PAS)染色，但PAS染色不十分靈敏，染色后通常形成較淺的紅-粉紅帶，難以在凝膠中觀察。目前更靈敏的方法是將凝膠印跡后(下面介紹)用凝集素檢測糖蛋白。凝集素是從植物中提取的一類糖蛋白，它們能識別并選擇性的結合特殊的糖，不同的凝集素可以結合不同的糖。將凝膠印跡用凝集素處理，再用連接辣根過氧化物酶的抗凝集素抗體處理，然后再加入過氧化物酶的底物，通過生成有顏色的產物就可以檢測到凝集素結合情況。這樣凝膠印跡用不同的凝集素檢測不僅可以確定糖蛋白，而且可以得到糖蛋白中糖基的信息。

通過掃描光密度儀對染色的凝膠進行掃描可以進行定量分析，確定樣品中不同蛋白質的相對含量。掃描儀測定凝膠上不同遷移距離的吸光度值，各個染色的蛋白帶形成對應的峰，峰面積的大小可以代表蛋白質的含量的多少。另外一種簡單的方法是將染色的蛋白帶切下來，在一定體積的50%吡啶溶液中搖晃過夜溶解染料，而后通過分光光度計測定吸光度值就可以估算蛋白質的含量。但應注意，蛋白質只有在一定的濃度范圍內其含量才與吸光度值成線性關系，另外不同的蛋白質即使在含量相同的情況下染色程度也可能有所不同，所以上面的方法對蛋白質含量的測定只能是一種半定量的結果。

盡管凝膠電泳通常是作為一種分析工具使用，它也可以用于蛋白質的純化制備。但電泳后需將蛋白質從凝膠中回收，通常是將所需的蛋白質區帶部分的凝膠切下，通過電泳的方法將蛋白質從凝膠中洗脫下來(稱為電洗脫)。目前有各種商品電洗脫池裝置。最簡單的方法是將切下的凝膠裝入透析袋內加入緩沖液浸泡，再將透析袋浸入緩沖液中進行電泳，蛋白質就會向某個電極方向遷移而離開凝膠進入透析袋內的緩沖液。由于蛋白質不能通過透析袋，所以電泳后蛋白質就留在透析袋的緩沖液中。電洗脫后可通一個反向電流，持續幾秒鐘，使吸附在透析袋上的蛋白質進入緩沖液，這樣就可以將凝膠中的蛋白質回收。

4.13 蛋白質印跡(Western blotting)

印跡法(blotting)是指將樣品轉移到固相載體上，而后利用相應的探測反應來檢測樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉移到硝酸纖維素膜(NC膜)上，并利用DNA-RNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質進行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質分子的印跡分析稱為Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。

蛋白質印跡法首先是要將電泳后分離的蛋白質從凝膠中轉移到硝酸纖維素膜上，通常有兩種方法：毛細管印跡法和電泳印跡法。毛細管印跡法是將凝膠放在緩沖液浸濕的濾紙上，在凝膠上放一片硝酸纖維素膜，再在上面放一層濾紙等吸水物質并用重物壓好，緩沖液就會通過毛細作用流過凝膠。緩沖液通過凝膠時會將蛋白質帶到硝酸纖維素膜上，硝酸纖維素膜可以與蛋白質通過疏水相互作用產生不可逆的結合。這個過程持續過夜，就可以將凝膠中的蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上。但這種方法轉移的效率較低，通常只能轉移凝膠中一小部分蛋白質(10%～20%)。電泳印跡可以更快速有效的進行轉移。這種方法是用有孔的塑料和有機玻璃板將凝膠和硝酸纖維素膜夾成“三明治”形狀，而后浸入兩個平行電極中間的緩沖液中進行電泳，選擇適當的電泳方向就可以使蛋白質離開凝膠結合在硝酸纖維素膜上。轉移后的硝酸纖維素膜就稱為一個印跡(blot)，用于對蛋白質的進一步檢測。印跡首先用蛋白溶液(如10%的BSA)處理以封閉硝酸纖維素膜上剩余的疏水結合位點，而后用所要研究的蛋白質的抗血清(一抗)處理，印跡中只有待研究的蛋白質與一抗結合，而其它蛋白質不與一抗結合，這樣清洗去除未結合的一抗后，印跡中只有待研究的蛋白質的位置上結合著一抗。處理過的印跡進一步用適當標記的二抗處理，二抗是指一抗的抗體，如一抗是從鼠中獲得的，則二抗是抗鼠Ig G的抗體。處理后，帶有標記的二抗與一抗結合，可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白質的位置。目前有結合各種標記物的抗特定Ig G的抗體可以直接購買作為標記的二抗。最常用的一種是酶連的二抗，印跡用酶連二抗處理后，再用適當的底物溶液處理，當酶純化底物生成有顏色的產物時，就會產生可見的區帶，指示所要研究的蛋白質的位置。在酶連抗體中使用的酶通常是堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。堿性磷酸酶可以將無色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸鹽(BCIP)轉化為藍色的產物;而辣根過氧化物酶可以以H2O2為底物，將3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色產物或將4-氯萘酚氧化成藍色產物。另一種檢測辣根過氧化物酶的方法是用增強化學發光法，辣根過氧化物酶在H2O2存在下，氧化化學發光物質魯米諾(luminol，氨基苯二酰一肼)并發光，在化學增強劑存在下光強度可以增大1000倍，通過將印跡放在照相底片上感光就可以檢測辣根過氧化物酶的存在。除了酶連二抗作為指示劑，也可以使用其它指示劑，主要包括以下一些：

I125標記的二抗可以通過放射性自顯影檢測。

熒光素異硫氰酸鹽標記的二抗可以通過在紫外燈下產生熒光來檢測。

I125標記金黃色葡萄球菌蛋白A(Protein A)：Protein A可以與Ig G的Fc區特異性的結合，因此Protein A可以代替二抗：I125標記的Protein A通過放射性自顯影檢測。

金標記的二抗：二抗通過微小的金顆粒包裹，與一抗結合時可以表現紅色。

生物素結合的二抗：印跡用生物素結合的二抗處理后，再用堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶標記的凝集素處理。生物素可以與凝集素緊密結合，這種方法實際上相當于通過生物素與凝集素的緊密結合將二抗與酶連接，通過酶的顯色反應就可以進行檢測。這種方法的優點是由于生物素是一個小分子蛋白，一個抗體上可以結合多個生物素，也就可以結合多個酶連接的凝集素，可以大大增強顯色反應的信號。

除了使用抗體或蛋白作為檢測特定蛋白的探針以外，有時也使用其它探針如放射性標記的DNA，可以檢測印跡中的DNA結合蛋白。

4.14 毛細管電泳

毛細管電泳(capillary electrophoresis, CE)又叫高效毛細管電泳(HPCE), 是近年來發展最快的分析方法之一。1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在75 內徑毛細管柱內用高電壓進行分離, 創立了現代毛細管電泳。1984年Terabe等建立了膠束毛細管電動力學色譜。1987年Hjerten 建立了毛細管等電聚焦, Cohen和Karger提出了毛細管凝膠電泳。1988～1989年出現了第一批毛細管電泳商品儀器。短短幾年內, 由于CE符合了以生物工程為代表的生命科學各領域中對多肽、蛋白質(包括酶，抗體)、核苷酸乃至脫氧核糖核酸(DNA)的分離分析要求, 得到了迅速的發展。CE是經典電泳技術和現代微柱分離相結合的產物。CE和高效液相色譜法(HPLC)相比, 其相同處在于都是高效分離技術, 儀器操作均可自動化, 且二者均有多種不同分離模式。二者之間的差異在于：CE用遷移時間取代HPLC中的保留時間, CE的分析時間通常不超過30min, 比HPLC速度快;對CE而言, 從理論上推得其理論塔板高度和溶質的擴散系數成正比, 對擴散系數小的生物大分子而言, 其柱效就要比HPLC高得多;CE所需樣品為nl級, 最低可達270fl, 流動相用量也只需幾毫升, 而HPLC所需樣品為μl級, 流動相則需幾百毫升乃至更多;但CE僅能實現微量制備, 而HPLC可作常量制備。CE和普通電泳相比, 由于其采用高電場, 因此分離速度要快得多;檢測器則除了未能和原子吸收及紅外光譜連接以外, 其它類型檢測器均已和CE實現了連接檢測;一般電泳定量精度差,而CE和HPLC相近;CE操作自動化程度比普通電泳要高得多。總之, CE的優點可概括為三高二少：高靈敏度, 常用紫外檢測器的檢測限可達10-13～10-15mol,激光誘導熒光檢測器則達10-19～10-21mol;高分辨率, 其每米理論塔板數為幾十萬;高者可達幾百萬乃至千萬, 而HPLC一般為幾千到幾萬;高速度, 最快可在60s內完成, 在250s內分離10種蛋白質, 1.7min分離19種陽離子, 3min內分離30種陰離子; 樣品少, 只需nl (10-9 L)級的進樣量;成本低, 只需少量(幾毫升)流動相和價格低廉的毛細管。由于以上優點以及分離生物大分子的能力, 使CE成為近年來發展最迅速的分離分析方法之一。當然CE還是一種正在發展中的技術, 有些理論研究和實際應用正在進行與開發。

“CE”統指以高壓電場為驅動力, 以毛細管為分離通道, 依據樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現分離的一類液相分離技術。(見圖16 毛細管電泳儀器示意圖)。其儀器結構包括一個高壓電源, 一根毛細管, 一個檢測器及兩個供毛細管兩端插入而又可和電源相連的緩沖液貯瓶。在電解質溶液中, 帶電粒子在電場作用下, 以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移的現象叫電泳。CE所用的石英毛細管柱, 在pH>3情況下, 其內表面帶負電, 和溶液接觸時形成了一雙電層。在高電壓作用下, 雙電層中的水合陽離子引起流體整體地朝負極方向移動的現象叫電滲, 粒子在毛細管內電解質中的遷移速度等于電泳和電滲流(EOF)兩種速度的矢量和, 正離子的運動方向和電滲流一致, 故最先流出;中性粒子的電泳流速度為“零”，故其遷移速度相當于電滲流速度;負離子的運動方向和電滲流方向相反, 但因電滲流速度一般都大于電泳流速度, 故它將在中性粒子之后流出, 從而因各種粒子遷移速度不同而實現分離。