菌種的誘導培養及蛋白的提取

實驗概要

本實驗通過搖瓶培養和發酵罐培養分別小量和大量誘導菌種表達，獲得了目的蛋白的粗提物，通過Amylose親和層析獲得純化蛋白。

主要試劑

LB培養基，2-YT培養基，誘導劑IPTG，5N氫氧化鈉，2N鹽酸，葡萄糖

主要設備

恒溫振蕩器，離心機，發酵罐

實驗材料

重組菌

實驗步驟

1. 搖瓶培養

  1) 取出4℃下平板保藏的菌種，挑取單菌落，接種于5ml LB培養基(含有Amp100ug/ml)的試管中，37℃,300r/min,恒溫振蕩培養,過夜活化;

  2) 然后按5%的接種量將活化菌種接入到含100m1 2-YT培養基(含有Amp 100ug/ml)的500mI搖瓶中，37℃, 300 r/min,恒溫振蕩培養，作為2L搖瓶培養的菌種。

  3) 然后按5%的接種量將活化菌種接入到含400m1 2-YT培養基(含有Amp 100ug/ml)的2L的搖瓶中，37℃, 300 r/min,恒溫振蕩培養。

起始誘導時機為菌體OD₆₀₀=4，誘導劑IPTG (IPTG貯液:濃度為20%, 0.22um膜過濾除菌，分裝后-20℃凍存。)濃度為0.03 mmol/L，誘導表達的時間控制在4h左右。

 2. 5L發酵罐培養

  1) 取出4℃下平板保藏的菌種，挑取單菌落，接種于5ml LB培養基(含有Amp100ug/ml)的試管中，37℃, 300 r/min,恒溫振蕩培養。過夜活化;

  2) 然后按5%的接種量將活化菌種接入到含100ml 2-YT培養基(含有Amp 100ug/ml)的500mI搖瓶中，37℃, 300r/min,恒溫振蕩培養，作為5L發酵罐的菌種。

在基因工程菌株5L高密度發酵過程中，溫度由系統自動控制在37℃，通過自動流加5N氫氧化鈉和2N的鹽酸使pH保持在7左右，葡萄糖的流加采用恒速流加，即培養5h后開時流加補料，以0.042g. (L. min)^-1葡萄糖的的速率進行補料。發酵的IPTG誘導時機均為OD₆₀₀約為3時進行誘導，IPTG的濃度為0.1 mg/ml。

3. 目的蛋白粗提物的獲得

 1) 試劑配制

  CB(Column Buffer)緩沖液:

  Tris-HCl    20mmol/L(pH 7.4)

  NaCI    200mmol/L

  ED TA    1 mmol/L

  PH    7.4

稱11.7g NaCI, 0.37g EDTA,取20ml Tris-HCl，用NaOH調至PH7.4，加超純水至1L，用0.22um濾膜濾菌。

  2) 提取方法

發酵液以8 000r/min離心30min收集菌體。菌體收集后用無菌水洗二遍，以洗去表面殘留的培養基。按1:10的比例(W/V)把菌體懸浮在CB溶液中，超聲波破碎細胞，功率40W，每破碎l0s后間隔2s，每5min取樣，用Bradford法測定可溶性蛋白總量，確定最佳破碎時間。破碎過程中保持低溫(0℃)，完全破碎后于4℃以10 000 r/min離心30min，上清液用于上柱純化。

 4. Amylose親和層析

  1) 試劑配制

    a. CB(Column Buffer)緩沖液同上

    b. CB加麥芽糖(10mmol/L ):稱取3.6g麥芽糖，用CB配成1L溶液，用0.22um濾膜濾菌;

    c. 0.1%SDS:稱1g SDS，加超純水至1L，用0.22um濾膜濾菌。

  2) 層析步驟

    a.柱子的清洗:先用20%酒精潤洗柱子2次，裝柱;

    b.柱子的平衡:新柱料用5倍體積的CB洗柱，再生柱料用3倍體積的CB平衡，流速為2m1/min;

    c. 上樣:流速為0.5ml/min;

    d. 洗雜:用CB洗柱至流出液的A值與空白(即CB)相同，流速為2ml/min;

    e. 洗脫:用CB加麥芽糖洗脫，流速為0.5ml/min，分步收集產品進行SDS-PAGE分析，確定最佳洗脫條件;將接下的樣品取一小樣，留做檢；

    f. 柱料的再生:依次用3倍柱體積的無菌水、3倍柱體積的0.lmmol/L SDS溶液、1倍柱體積的無菌水洗柱，各步均須洗至基線;再用3倍柱體積的CB平衡柱料;

    g. 純化后樣品，用去離子水透析脫鹽或Sephadex G-25脫鹽柱脫鹽，經低溫真空離心濃縮機抽干成粉狀，低溫干燥保存。