WesternBlot、ELISA、免疫熒光與免疫組化技術
1 原理： 將通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質轉移到硝酸纖維素或PVDF膜上，然后與能特異性識別待檢蛋白的抗體進行反應，洗滌去除沒有結合的特異性抗體后，加入標記的、能識別特異性抗體的種屬特異性抗體，反應一段時間后再次洗滌去除非特異性結合的標記抗體，加入適合標記物的檢測試劑進行顯色或發光等，觀察有無特異性蛋白條帶的出現，也可通過條帶的密度大小來進行特異性蛋白的半定量。 2 操作過程 SDS-PAGE電泳→轉膜(PVDF或硝酸纖維素膜) 封閉→一抗→洗滌→酶標二抗反應 洗滌→顯色或化學發光顯影 Western blot analysis of the cleavage of Caspase-3. IM9/Bcl-2 Cells were treated with 20mM of gossypol for 4, 8 and 16 h. After treatmen......閱讀全文
Western－Blot、ELISA、免疫熒光與免疫組化技術
? 1 原理： 將通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質轉移到硝酸纖維素或PVDF膜上，然后與能特異性識別待檢蛋白的抗體進行反應，洗滌去除沒有結合的特異性抗體后，加入標記的、能識別特異性抗體的種屬特異性抗體，反應一段時間后再次洗滌去除非特異性結合的標記抗體，加入適合標記物的檢測試劑進行顯色或發光
蛋白質分析技術(Western－Blot、ELISA、免疫熒光與免疫組化技術)
1 原理：將通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質轉移到硝酸纖維素或PVDF膜上，然后與能特異性識別待檢蛋白的抗體進行反應，洗滌去除沒有結合的特異性抗體后，加入標記的、能識別特異性抗體的種屬特異性抗體，反應一段時間后再次洗滌去除非特異性結合的標記抗體，加入適合標記物的檢測試劑進行顯色或發光等，觀察有無特
蛋白質分析技術(ELISA、Western－Blot、免疫熒光與免疫組化技術)
一 Western Blot1 原理：將通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質轉移到硝酸纖維素或PVDF膜上，然后與能特異性識別待檢蛋白的抗體進行反應，洗滌去除沒有結合的特異性抗體后，加入標記的、能識別特異性抗體的種屬特異性抗體，反應一段時間后再次洗滌去除非特異性結合的標記抗體，加入適合標記物的檢測試劑
蛋白質分析技術(ELISA、Western－Blot、免疫熒光與免疫組化技...2
（2）間接法：細胞→3％多聚甲醛固定和滲透化→封閉→針對蛋白的特異抗體→洗滌→熒光素標記的二抗→洗滌 → 熒光顯微鏡觀察或流式細胞計分析凋亡相關蛋白TFAR19蛋白的表達和細胞定位分析TFAR19（PDCD5）是由本研究室在國際上首先報導的一個擁有自己知識產權的人類新基因，前期的功能研究表明，它是促
免疫組化技術與Western－blotting、ELISA的異同
1）Western blotting 蛋白質免疫印跡，也是利用抗體抗原反應原理，結合化學發光等技術來檢查組織或細胞樣品內蛋白含量的檢測方法。與免疫組化技術相比，定量可能更加準確；當然Western blotting也可定性和定位（通過提取膜蛋白或核蛋白、胞漿蛋白分別檢測其中抗原含量，進而間接反
Western－Blot－相關技術操作與原理2
一、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳??? ?30%丙烯酰胺-雙丙烯酰胺溶液?4 ×?濃縮膠緩沖液?(Stacking gel Buffer, pH 6.8)?4 ×?分離膠緩沖液?(Resolving gel buffer pH 8.8)?10 × SDS-PAGE電泳緩沖液?10 ×?蛋白電轉移緩沖液
Western－Blot－相關技術操作與原理1
【實驗原理】：?Western Blot?印跡方法，又稱為免疫印記，是將獲得的蛋白質樣品通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，對不同分子量的蛋白質進行分離，并通過轉移電泳將凝膠上分離到的蛋白質轉印至固相支持物（NC膜或PVDF膜）上，用抗靶蛋白的非標記抗體（一抗）與轉印后膜上的靶蛋白進行特異性結合，再與經
蛋白質分析技術(WesternBlot－ELISA免疫熒光與免疫組化技術)2
2 類型（1）間接法測抗體間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體，檢測與固相抗原結合的受檢抗體，故稱為間接法。?常用于臨床血清中自身抗體的檢測，以及雜交瘤上清特異性抗體的篩選。如血清中PDCD5自身抗體的檢測。(2) 雙抗體夾心法測抗原是檢測抗原最常用的方法。只要獲得針對受檢抗原的特
蛋白質分析技術(WesternBlot－ELISA免疫熒光與免疫組化技術)3
（一）細胞膜蛋白分子的檢測原理：細胞膜表面的抗原或受體可特異地與相應的抗體或配體結合，將針對細胞表面抗原的抗體或配體用不同的熒光素標記，根據不同熒光物質的最大激發和發射波長的不同，即可準確定量每種熒光物質的強度，從而推出相應細胞表面抗原表達量1 直接法：細胞＋熒光素標記的抗CD分子的抗體→4oC反應
蛋白質分析技術(WesternBlot－ELISA免疫熒光與免疫組化技術)4
四免疫組織化學技術原理：是指酶標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的成色反應，對相應的抗原進行定性、定位和定量測定的一項技術。它把免疫反應的特異性、組織化學的可見性巧妙的結合起來，借助顯微鏡（包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡等）的顯像和放大作用，在細胞、亞細胞水平檢測各種抗原物質（如蛋
Western－Blot技術實驗流程
Western Blot又稱為蛋白質印跡，是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的基于抗體抗原之間特異免疫反應的一種定量或定性檢測蛋白的實驗方法。基本原理：聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同分子量的蛋白質樣品分離，分離后的蛋白被轉移到固相支撐物（雜交膜）上，抗體特異性識別目標蛋白，通過酶促反應或者化學發光等
Western－Blot技術實驗流程
Western Blot又稱為蛋白質印跡，是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的基于抗體抗原之間特異免疫反應的一種定量或定性檢測蛋白的實驗方法。 基本原理：聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同分子量的蛋白質樣品分離，分離后的蛋白被轉移到固相支撐物（雜交膜）上，抗體特異性識別目標蛋白，通過酶促反應或
Western－Blot轉膜技術要點
這個年過的有點崎嶇，在面對社會性問題時疫情給我們帶來了很多正能量，相信很多還沒返校的人已經給自己立了flag。在我們回望過去的一年，這個時代已經變了。任何的進步都被透明公開的呈現在我們面前，而我們看到的好消息遠比自己收獲的多，所以我們總忍不住問自己，“我成長了嗎？”“我的實驗能順利些嗎？” “我的科
Western－Blot轉膜技術要點
這個年過的有點崎嶇，在面對社會性問題時疫情給我們帶來了很多正能量，相信很多還沒返校的人已經給自己立了flag。在我們回望過去的一年，這個時代已經變了。任何的進步都被透明公開的呈現在我們面前，而我們看到的好消息遠比自己收獲的多，所以我們總忍不住問自己，“我成長了嗎？”“我的實驗能順利些嗎？” “我
免疫共沉淀與Western－Blot
免疫共沉淀與Western Blot實驗步驟:1．以60mm 細胞培養皿為例，細胞轉染后24－36 小時后，吸凈培養液（可用PBS小心漂洗一次）。2．加入500μl 預冷的1×lysis buffer, 于4℃或冰上放置裂解細胞5 分鐘。3．將細胞裂解液轉移到1.5 ml eppondorf 管內，
Western－Blot技術篇之樣品制備
Western Blot 是一種用于檢測蛋白質以及蛋白質翻譯后修飾的常用方法，可以對簡單或復雜生物樣品中的目標蛋白質進行半定量或定量分析。其操作步驟包括： 從細胞、組織或體液中制備樣品（蛋白質提取和蛋白質濃度測量） 十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙烯酰胺凝膠通過電泳按大小分離蛋白質
Western－Blot技術篇之樣品制備
Western Blot 是一種用于檢測蛋白質以及蛋白質翻譯后修飾的常用方法，可以對簡單或復雜生物樣品中的目標蛋白質進行半定量或定量分析。其操作步驟包括： 從細胞、組織或體液中制備樣品（蛋白質提取和蛋白質濃度測量） 十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙烯酰胺凝膠通過電泳按大小分離蛋白質
Western－Blot技術篇之樣品制備
Western Blot 是一種用于檢測蛋白質以及蛋白質翻譯后修飾的常用方法，可以對簡單或復雜生物樣品中的目標蛋白質進行半定量或定量分析。其操作步驟包括： 從細胞、組織或體液中制備樣品（蛋白質提取和蛋白質濃度測量） 十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙烯酰胺凝膠通過電泳按
Western－Blot技術篇之樣品制備
Western Blot 是一種用于檢測蛋白質以及蛋白質翻譯后修飾的常用方法，可以對簡單或復雜生物樣品中的目標蛋白質進行半定量或定量分析。其操作步驟包括：?從細胞、組織或體液中制備樣品（蛋白質提取和蛋白質濃度測量） 十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙烯酰胺凝膠通過電泳按大小分離蛋白質 將分離的蛋白
Western－Blot－Protocol
一、提取抗原蛋白將提取RNA途中留存的樣品，加入150μl 100%酒精充分混勻，靜置5min(RT), 2000×g , 4℃離心5min,?吸取上清至新管中,?加入750μl異丙醇,?混勻,?靜置10min(RT), 12000×g, 4℃離心10min,?棄上清,?加入1ml 0.3mol/L
Western－Blot－(AP)
主要試劑1. Membrane Blocking buffer:5% Milk ? 0.05% of Tween 20 PBS2. antibody dilution buffer: PBS 0.05% of Tween20 1.0% Milk(or BSA)?3. washing buffer:?
western－blot原理
Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，經過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體上，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢
Western－Blot詳解
Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。 本文主要通過以下幾個方面來詳細地介紹一下Western Blot技術: 一、原理 二、分類
Western－Blot實驗（一）
大家都知道Western Blot時間周期較長，大致可以分為忙碌的第一天，和心痛的第二天，像極了愛情。人生若只如初見，何事秋風悲畫扇。經歷轉瞬即逝的新手曙光后，便進入漫長的黑夜。第一天，從最一步的配膠，到最后一步的孵育膜都極細心像極了愛情的萌芽期，需要精心的呵護。第二天經過繁瑣的洗膜，孵二抗，洗膜，
Western－Blot實驗（二）
小巧的體格，卻一應俱全，可以靈活控制多種應用程序，包括化學發光，熒光，DNA/蛋白膠。可以滿足對實驗室各種樣品成像的要求。是目前市面上唯一的一款既可進行Cy3, Cy5, Cy2 多色熒光LED成像，又可在700和800nm處進行近紅外激光定量熒光western 成像系統。這達到對成像最完美
western－blot試驗心得
前兩天做了一個western blot,現在把試驗中的一點小小的體會發上來，與大家交流，希望大家多多指點！1 本實驗室采用的脫脂奶粉已經存放了近兩年了，雖然是四攝氏度保存，但是其封閉質量還是難以保證的。所以本人的試驗結果中出現了小斑點。建議最好使用BSA或專用的脫脂奶粉進行封閉，雖然貴點，但還是有個
Western－Blot－with－Platelet－Protein
OUTLINEWestern blot is a wide used technique to identify a target protein/s for the certain antibody.PROTOCOLPrepare platelets.Lyse washed platelets (
Western－Blot詳解（四）
還有一種離子交換型膜是羧甲基（CM）修飾的纖維素膜，它可以結合蛋白和多肽分子，以及其他的一些帶正電荷的樣品，最適結合pH范圍在4-7。結合的多肽分子可以從CM膜上洗脫下來，用于氨基酸系列分析或微測序。5.Marker的相關疑問MM.我用的是可視marker（BIO_RAD），但是電泳總跑不全8條帶，
Western－Blot詳解（七）
TTT.目的蛋白是一種6KD的分泌性蛋白，RT－PCR就顯示細胞中mRNA表達不高，估計將培養上清凍干濃縮后采用Western Blot還可能檢測不出，但如果用western，是否一定要用0.2μm的膜？用Tris-tricine SDS－PAGE電泳，電泳時分別管制三層凝膠，分離膠用40％
Western－Blot詳解（八）
DDDD.顯色目的條帶又細又淺，靶蛋白是27KD的bcl-xl和67KD 的c-myc，應該是高表達。每個涌道上50-70μg蛋白，開始用半干轉移，后來用濕轉14v，16h，用PVDF膜轉移。膠轉移后染色檢測，發現小分子量的基本轉移走了，可是為什么條帶老是不粗不濃呢?解答：可能跟你的一抗有關