蛋白純化實驗一些常見問題總結
蛋白純化過程中常遇見一些問題，這里整理了下幾個蛋白純化實驗中的遇見的問題及其解決方式。1)我現在手頭有個融合蛋白，純化的時候用助溶劑溶解后做了GST親和層析，之后用蛋白酶切割后卻發現目的蛋白沒有活性。請問有哪些可能會出現這種原因?怎么解決?測過基因序列，沒有問題。細胞破碎后，融合蛋白在沉淀里，我用助溶劑提取后，可以用GST做親和層析，但效率只有50～60%左右。洗脫完融合蛋白不需要助溶劑，但這樣的條件下切割完后目的蛋白會沉淀，我用0.5%CHAPS助溶可勉強溶解部分，目的蛋白疏水性比較強。既然是疏水性很強你可以加點甘油或者乙二醇降低極性，這樣溶解就會好得多，此外你也直接加2%的PEG這樣也降低極性，同時保護你的蛋白，你再做純化就可以了，我以前遇到這樣的蛋白是用10%的乙醇加3-5%的PEG5000，這樣的情況下蛋白還是活性回收率很高，我覺得那些表面活性劑能不用還是不用的好，你失去活性你可以監測一下提取，純化，酶切到底哪里失去了活......閱讀全文
膜蛋白的純化實驗
實驗步驟 一、膜的制備 從細胞或組織中分離質膜是純化膜蛋白的第一步。由于缺少能有效分離去污劑增溶的膜蛋白的生化方法，因此在質膜成分純化上投人一些時間會對后續步驟的結果有利。 大多數膜蛋白的含量較低, 因此選擇易于大量獲取并能
膜蛋白的純化實驗
實驗步驟一、膜的制備從細胞或組織中分離質膜是純化膜蛋白的第一步。由于缺少能有效分離去污劑增溶的膜蛋白的生化方法，因此在質膜成分純化上投人一些時間會對后續步驟的結果有利。大多數膜蛋白的含量較低, 因此選擇易于大量獲取并能高表達目的膜蛋白的組織或細胞系就很重要。最近，人們對于將細胞表面蛋白質作為鑒定不同
蛋白質的純化實驗
膠體過濾法 ? ? ? ? ? ? 實驗材料 Sephacryl S-300膠體 試劑、試劑盒
蛋白質的純化實驗
不發生電泳現象，蛋白質粒子帶負電荷，在電場中向負極移動，蛋白質粒子帶正電荷；在等電點偏堿性溶液中，在電場中向正極移動，可以將蛋白質進行分離純化。這種現象稱為蛋白質電泳(Electrophoresis).蛋白質的分離純化的一般原則①高回收率②高純度③高活性④方便與快捷⑤經濟蛋白質的分離純化的一般步驟①
蛋白質的純化實驗
實驗材料 Sephacryl S-300膠體試劑、試劑盒 緩沖液buffer A-150儀器、耗材 色析管柱鐵夾試管鐵架水平儀收集器濃縮用離心機 濃縮用離心管實驗步驟 一、儀器設備色析管柱 （Pharmacia C column, 1.6×100 cm）、鐵架、鐵夾及水平儀；部分收集器（frac
純化剪接因子SR蛋白實驗
實驗方法原理 前體 mRNA ( pre-mRNA ) 剪接因子 SR（serine/argininc rich，富含絲/蘇氨酸）蛋白家族是將剪接體組裝到前體 mRNA 上的重要參與者。SR 蛋白是重要的剪接因子，該家族的不同成員可以在體外或體內指導選擇性剪接位點的選擇。實驗材料 超純硫酸銨
純化剪接因子SR蛋白實驗
前體 mRNA ( pre-mRNA ) 剪接因子 SR（serine/argininc rich，富含絲/蘇氨酸）蛋白家族是將剪接體組裝到前體 mRNA 上的重要參與者。SR 蛋白是重要的剪接因子，該家族的不同成員可以在體外或體內指導選擇性剪接位點的選擇。本實驗來源「RNA 實驗指導手冊」主編：鄭
純化剪接因子SR蛋白實驗
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 前體 mRNA ( pre-mRNA ) 剪接因子 SR（serine/argininc rich，富含絲/蘇氨酸）蛋白家族是將剪接體組裝到前體 mRNA 上的重要參與者。SR 蛋白是重要的剪接因子，該家族的不同成員可以
膜蛋白的純化實驗（一）
一、膜的制備從細胞或組織中分離質膜是純化膜蛋白的第一步。由于缺少能有效分離去污劑增溶的膜蛋白的生化方法，因此在質膜成分純化上投人一些時間會對后續步驟的結果有利。大多數膜蛋白的含量較低, 因此選擇易于大量獲取并能高表達目的膜蛋白的組織或細胞系就很重要。最近，人們對于將細胞表面蛋白質作為鑒定不同
膜蛋白的純化實驗（二）
三、膜蛋白的純化一 旦 使 用 了 合 適 的 去 污 劑 將 膜 蛋 白 從 細 胞 膜 中 増 溶 出 來 ，就 可 以 分 離 目 標 蛋 白 質 了 。傳 統 色 譜 層 析 技 術 ，如 凝 膠 過 濾 、親 和 、離 子 交 換 和 層 析 聚 焦 （chromatofocusi
肌肉肌球蛋白和肌動蛋白純化實驗_DEAE純化肌肉肌球蛋白
實驗材料肌肉肌球蛋白試劑、試劑盒焦磷酸鈉柱平衡緩沖液柱緩沖液高鹽緩沖液肌球蛋白-DEAE 透析緩沖液儀器、耗材SDS-PAGE實驗步驟一、準備 DEAE 柱和材料1. 準備貯存液和材料200 mmol/L 焦磷酸鈉（NaPPi )，pH 7.0用 HCl 和 H3PO4?調 NaPPi 溶液的 pH
肌肉肌球蛋白和肌動蛋白的純化實驗——肌球蛋白的純化
實驗材料冷凍肌肉試劑、試劑盒肌球蛋白抽提溶液儀器、耗材玻璃器皿實驗步驟1. 準備下面的貯存液（都冷卻到 4℃）。肌球蛋白抽提溶液：0.5 mol/L KCl，0.1 mol/L K2HPO4幾升冷的用玻璃器皿蒸餾過的水（dH2O）4 mol/L KCl0.5 mol/L KCI0.5 mol/L C
純化非肌肉肌球蛋白實驗
細胞勻漿 非肌肉肌球蛋白的層析純化 實驗材料 細胞 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 試劑、試劑盒 緩沖鹽溶液 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
制備和純化－mRNA－顯示蛋白實驗
實驗材料DNA 庫不含甲硫氨酸的翻譯混合物試劑、試劑盒MgCl2核苷三磷酸溶液轉錄緩沖液去離子超濾水T7 RNA 聚合酶固體 EDTA尿素緩沖液NaCl乙醇EDTAATPT4 多核苷酸激酶緩沖液T4 多核苷酸激酶T4 DNA 連接酶緩沖液T4 DNA 連接酶乙酸鉀溶液兔網織紅細胞裂解物翻譯試劑盒氯化
純化非肌肉肌球蛋白實驗
細胞勻漿 非肌肉肌球蛋白的層析純化 ? ? ? ? ? ? 實驗材料 細胞 試劑、試劑盒
制備和純化－mRNA－顯示蛋白實驗
基本方案 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 實驗材料 DNA 庫 不含甲硫氨酸的翻譯混合物
GST融合蛋白的親和純化實驗
實驗方法原理瓊脂糖顆粒和誘餌蛋白復合體在洗滌時并不會損失而且所有反應都含有等量的誘餌蛋白。為了證明在洗滌期間沒有任何材料損失，應使用 1/10 的 GST 融合體加樣做平行 SDS-PAGE 凝膠電泳并染色以便更確切地比較 GST 融合體蛋白帶。另外，融合蛋白的降解可能導致誘餌蛋白的量減少，尤其是當
GST融合蛋白的親和純化實驗
GST 共結合純化法 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 瓊脂糖顆粒和誘餌蛋白復合體在洗滌時并不會損失而且所有反應都含有等量的誘餌蛋白。為了證明在洗滌期間沒有任何材料損失，應使用
GST融合蛋白的親和純化實驗
實驗方法原理 瓊脂糖顆粒和誘餌蛋白復合體在洗滌時并不會損失而且所有反應都含有等量的誘餌蛋白。為了證明在洗滌期間沒有任何材料損失，應使用 1/10 的 GST 融合體加樣做平行 SDS-PAGE 凝膠電泳并染色以便更確切地比較 GST 融合體蛋白帶。另外，融合蛋白的降解可能導致誘餌蛋白的量減少
制備和純化－mRNA－顯示蛋白實驗
實驗方法原理 實驗材料 DNA 庫不含甲硫氨酸的翻譯混合物試劑、試劑盒 MgCl2核苷三磷酸溶液轉錄緩沖液去離子超濾水T7 RNA 聚合酶固體 EDTA尿素緩沖液NaCl乙醇EDTAATPT4 多核苷酸激酶緩沖液T4 多核苷酸激酶T4 DNA 連接酶緩沖液T4 DNA 連接酶乙酸鉀溶液兔網織
純化非肌肉肌球蛋白實驗——非肌肉肌球蛋白的層析純化
實驗材料非肌肉肌球蛋白試劑、試劑盒勻漿緩沖液肌動蛋白聚合緩沖液凝膠過濾 羥基磷灰石緩沖液GF HT 緩沖液儀器、耗材大容量轉頭實驗步驟高速離心和 DEAE 層析1. 用不含除了 PMSF 以外的蛋白水解抑制劑的勻漿緩沖液平衡 DEAE 纖維素，取 50 ml 裝到 2.5cm x 35cm 有合適管
非肌肉肌動蛋白的純化實驗
實驗材料 非肌肉肌動蛋白 試劑、試劑盒 DNA 酶Ⅰ緩沖液 儀器、耗材 DEAE 柱 實驗步驟 1. 準備貯存液和材料。 2x DNA 酶Ⅰ緩沖液： 20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0 1 mmol/L DTT 0.4 mmol
非肌肉肌動蛋白的純化實驗
? ? ? ? ? ? 實驗材料 非肌肉肌動蛋白 試劑、試劑盒 DNA 酶Ⅰ緩沖液 儀器、耗材
非肌肉肌動蛋白的純化實驗
非肌肉肌動蛋白的純化實驗材料非肌肉肌動蛋白 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?試劑、試劑盒DNA 酶Ⅰ緩沖液 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
抗原標記蛋白復合體純化實驗
實驗方法原理 首先通過逆轉錄病毒介導的轉基因（用于組成型表達）或四環素調控的系統（用于可誘導表達）建立表達抗原決定簇標記的蛋白復合體亞基的穩定細胞系。然后用抗原決定簇特異的單克隆抗體偶聯的小珠進行免疫親和純化，以沉降抗原決定簇標記的多亞基蛋白復合體。最后在中性 pH 或生理條件下洗脫回收，即可用
重組G蛋白偶聯受體的純化實驗
實驗步驟 一、引言 天然的整合膜蛋白的量并不充足。因此對其的結構測定和功能分析需要:①重組膜蛋白的生產系統;②能分離得到有活性的膜蛋白（而不是沒有功能、折疊錯誤的膜蛋白）的純化策略。表達并純化原核和真核的膜蛋白在文獻中都有報道。讀者
抗原標記蛋白復合體純化實驗
組成型表達FLAG標記 條件性表達FLAG標記 變化起始材料和洗脫條件 用P11離子交換層析柱 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 首先通過逆轉錄病毒
重組G蛋白偶聯受體的純化實驗
純化受體從概念上可以分成兩步: 第一步用合適的去污劑將受體從膜中提取出來 (增溶）; 第二步使用如常規的親和標簽、與該受體特異結合的配體層析柱、分子排阻色譜和其他方法純化受體。最重要的是，必須注意選擇實驗條件以保持膜蛋白在整個純化過程中處于活性狀態。這一點怎么強調也不過分，因為很多 GPCR—旦被去
蛋白質的表達、分離、純化實驗
實驗方法原理 攜帶有目標蛋白基因的質粒在大腸桿菌BL21中，在 37℃，IPTG誘導下，超量表達攜帶有6個連續組氨酸殘基的重組氯霉素酰基轉移酶蛋白，該蛋白可用一種通過共價偶連的次氨基三乙酸（NTA）使鎳離子（Ni2+）固相化的層析介質加以提純，實為金屬熬合親和層析（MCAC）。蛋白質的純化程
細菌蛋白提取與純化的實驗手冊
不同的蛋白質分離純化的方法不同，但蛋白質分離純化的操作步驟基本類似，那么如何進行細菌蛋白的提取呢？這里總結細菌蛋白的提取的實驗試劑、操作步驟以及一些注意事項。實驗試劑采用T7? Tag Affinity Purification KitT7?Tag抗體瓊脂。B/W緩沖液：4.29mM Na2HPO4