目的基因的PCR克隆的原理（二）
此酶具有以下特點： （1）耐高溫，在70℃下反應2小時后其殘留活性在90%以上，在93℃下反應2小時后其殘留活性是仍能保持60%，而在95℃ 下反應2小時后為原來的40%。 （2）在熱變性時不會被鈍化，故不必在擴增反應的每輪循環完成后再加新酶。 （3）一般擴增的PCR產物長度可達2.0 kb，且特異性也較高。 PCR的廣泛應用得益于此酶，目前各試劑公司中開發了多種類型的Taq酶，有用于長片段擴增的酶，擴增長度極端可達40kb；有在常溫條件下即可應用的常溫PCR聚合酶；還有針對不同實驗對象的酶等。 一典型的PCR反應約需的酶量為 2.5u（總反應體積為50ml時），濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。 1.2.3 dNTP的質量與濃度 dNTP 的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度后，以 ......閱讀全文
PCR技術目的基因的直接克隆介紹
與常規的基因克隆方法相比，PCR的優點是快速，簡單，但是用PCR克隆目的基因的限制是必須知道側接靶序列的核苷酸序列，以制備引物。因而該法具有很大的局限性。 可直接利用具有平端的PCR產物進行克隆，但利用合適的引物，在待克隆的目的基因二側引入不同的限制性酶切點，則可將擴增之后的目的基因定向克隆到
目的基因片段的PCR擴增與克隆
1.PCR技術 PolymeraseChainReaction聚合酶鏈反應它是一種模擬天然DNA復制過程，在有DNA模板、DNA聚合酶（Taq酶）、RNA引物和四種dNTP的情況下，通過高溫變性（90℃－95℃，1－2min）,低溫退火（25℃－37℃，1－2min）,中溫延伸（60℃－75℃，90
目的基因的PCR克隆的原理（二）
此酶具有以下特點： （1）耐高溫，在70℃下反應2小時后其殘留活性在90%以上，在93℃下反應2小時后其殘留活性是仍能保持60%，而在95℃ 下反應2小時后為原來的40%。 （2）在熱變性時不會被鈍化，故不必在擴增反應的每輪循環完成后再加新酶。 （3）一般擴增的PCR產物長度可達2.0
目的基因的PCR克隆的原理（一）
1實驗原理 1.1聚合酶鏈式反應（PCR）的基本構成 PCR指在引物指導下由酶催化的對特定模板（克隆或基因組DNA）的擴增反應，是模擬體內DNA復制過程，在體外特異性擴增DNA片段的一種技術，在分子生物學中有廣泛的應用，包括用于DNA作圖、 DNA測序、分子系統遺傳學等。 PCR基本原理
目的基因的亞克隆
實驗材料?E.coli JM109試劑、試劑盒?牛肉膏胰蛋白胨NaCl微量細菌基因組抽提試劑盒BamH IXho1 核酸內切酶凝膠電泳回收試劑盒儀器、耗材?高速臺式冷凍離心機水平電泳儀漩渦混合儀紫外檢測儀凝膠成像分析系統微量移液器及吸頭
目的基因的亞克隆
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 亞克隆的基本過程包括：(1)目的DNA片段和載體的制備；(2)目的DNA片段和載體的連接；(3)連接產物的轉化；(4)重組子篩選。 實驗材料
目的基因的亞克隆
實驗題目 ：目的基因的亞克隆一、實驗目的1、掌握細菌基因組提取的方法和原理。2、掌握限制性核酸內切酶處理基因組及其結果分析。3、掌握基因片段回收的方法。二、實驗原理細菌基因組的提取：通過堿法或者酶法裂解細菌之后，可以將胞內的核酸和蛋白質全釋放出來。DNA溶于1mol/L的NaCl中，不溶于 0.
目的基因的亞克隆
目的基因的亞克隆所謂亞克隆就是對已經獲得的目的DNA片段進行重新克隆，其目的在于對目的DNA進行進一步分析，或者進行重組改造等。??? 亞克隆的基本過程包括：(1)目的DNA片段和載體的制備；(2)目的DNA片段和載體的連接；(3)連接產物的轉化；(4)重組子篩選。?一、試劑準備1．LB液體培養基：
目的基因的亞克隆
目的基因的亞克隆可應用于：（1）進一步分析目的基因；（2）基因重組。實驗方法原理亞克隆的基本過程包括：(1)目的DNA片段和載體的制備；(2)目的DNA片段和載體的連接；(3)連接產物的轉化；(4)重組子篩選。實驗材料E.coli JM109試劑、試劑盒牛肉膏胰蛋白胨NaCl微量細菌基因組抽提試劑盒
目的基因的亞克隆3
2． 調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環30-35次，最后在72℃ 保溫7min。3． 結束反應，PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。4．PC
目的基因的亞克隆2
2. 連接產物的轉化⑴ 取100μl貯存于-70℃鈣化菌，冰浴化開；⑵ 加入適量連接產物（一般不超過10μl，輕輕混勻，冰浴20min；⑶ 于42℃熱休克90s，迅速轉移至冰浴中，繼續冰浴2-3min；⑷ 加入LB液體培養基200μl，于37℃緩搖孵育45min；⑸ 將培養物適量涂于1.5%瓊脂LB
目的基因的亞克隆1
所謂亞克隆就是對已經獲得的目的DNA片段進行重新克隆，其目的在于對目的DNA進行進一步分析，或者進行重組改造等。亞克隆的基本過程包括：(1)目的DNA片段和載體的制備；(2)目的DNA片段和載體的連接；(3)連接產物的轉化；(4)重組子篩選。 一、試劑準備 1．LB液體培養基：胰化蛋白胨（細
PCR擴增制備目的基因
1．目的學會PCR操作的基本技術。2．原理是將待擴增的DNA模板加熱變性，與其兩側互補的寡聚核苷酸引物復性，然后經過耐熱的DNA聚合酶延伸。再進入下一輪變性—復性—延伸的循環，n次循環后DNA可被擴增（1+X）n倍。其中
目的基因的PCR擴增
實驗概要進行目的基因的PCR擴增實驗原理PCR（聚合酶鏈式反應）是一種選擇性體外擴增DNA或RNA的方法。它包括3個基本步驟：⑴變性：目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈；⑵退火：兩種寡核苷酸引物在適當溫度（50℃左右）下與模板上的目的序列通過氫鍵配對；⑶延伸：在Taq ? DNA聚合酶合成DNA的最適
目的基因的亞克隆（subcloning）2
四、連接產物的轉化1.感受態細胞的制備⑴ 保存于-70℃的DH5α（或其他菌種）用接種環劃菌于1.5%瓊脂平板上，37℃恒溫倒置培養至單菌落出現（約14-16 hr）。⑵ 挑取單菌落，接種于2.0ml LB液體培養基中，37℃恒溫，250g振蕩培養過夜（約12hr）。⑶ 取0.5ml 過夜培養液，接
目的基因的亞克隆（subcloning）1
所謂亞克隆就是對已經獲得的目的片段進行重新，其目的在于對目的進行進一步分析，或者進行重組改造等。亞的基本過程包括：(1)目的片段和載體的制備； (2)目的片段和載體的連接；(3)連接產物的轉化；(4)重組子篩選。一、試劑準備1．LB液體培養基：胰化蛋白胨（細菌培養用）10g，酵母提取物（細菌培養用）
原核表達之目的基因克隆
1. 了解實驗課題對目的蛋白的要求包括：目的蛋白分子量有多大，表達目的（是蛋白結晶、藥劑結合還是制備抗體，不同目的對蛋白要求不同）；是否要其可溶；是胞內表達還是分泌表達，是組成型表達還是誘導型表達；另外，還要了解蛋白表達后需要采用什么樣的方式進行純化，純化標簽有多大，蛋白純化后是否需要將標簽去除（即
常用的植物目的基因克隆技術
1、通過已知基因產物的分析和鑒定這類技術主要通過生物化學和病理學研究分離鑒定有關基因的蛋白產物，并對蛋白質氨基酸順序進行分析，推斷出編碼該蛋白質的基因序列，然后通過抗體、寡聚核苷酸探針或PCR制備的探針對文庫進行篩選來分離目的基因。如植物抗病蟲基因工程中常用的蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白基因（Bt基因）、
RTPCR擴增目的基因cDNA
實驗概要學習從細胞或組織的RNA中用逆轉錄PCR擴增目的基因的技術及操作。實驗原理普通PCR方法可以以DNA為模板擴增基因，但真核生物的基因組中通常分為可轉為mRNA的外顯子和不轉錄的成mRNA的內含子，所以從染色體DNA用PCR方法擴增出的基因是內含子和外顯子相間排列的DNA分子，不能用于基因工程
PCR技術應用基因克隆的應用
運用 PCR 技術、基因克隆和亞克隆比傳統的方法具有更大的優點。由于 PCR 可以對單拷貝的基因放大上百萬倍,產生微克(μg)級的特異 DNA 片段,從而可省略從基因組 DNA 中克隆某一特定基因片段所需要的 DNA的酶切、連接到載體 DNA 上、轉化、建立 DNA 文庫及基因的篩選、鑒定、亞克隆等
挑克隆鑒定時PCR有目的條帶但是酶切沒有
可能原因：1.PCR擴增的是假克隆，因為PCR驗證的可靠性不穩定。2.質粒中酶切位點變異你可以做如下實驗：1.看重組質粒的大小是不是比原始質粒大2.用提出的質粒做pcr，這樣比較可靠，用細菌做pcr的假陽性極高3.用別的酶再試一下，是否能切出目的片段。
利用pcr技術獲得目的基因的前提
D PCR是一項在生物體外復制特定的DNA片段的核酸合成技術；PCR技術的原理是DNA雙鏈復制；利用PCR技術獲取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列；PCR擴增中通過高溫解開雙鏈DNA。
利用PCR技術獲取目的基因的前提
通常的情況是：你已有的基因序列包含有目的基因（但并不是整個的已有序列都是目的基因），并且你根據你所掌握的目的基因的信息來設計引物（比如說你已經知道了目的基因的部分序列），這樣再利用PCR技術擴增，即可獲得你想要的目的基因，而那些不是目的基因的部分沒有得到擴增。并且在基因克隆技術中，目的就是要獲得大量
利用pcr技術擴增目的基因的前提
（1）PCR全稱為聚合酶鏈式反應，是一項在生物體外復制特定的DNA片段的核酸合成技術，前提，是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據這一序列合成引物．（2）轉化指的是目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程．（3）DNA分子雜交技術用于檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的
RACEPCR克隆基因的幾點建議
摘 要：? RACE是一種快速克隆cDNA末端的方法，目前, 該方法被廣泛應用于未知堿基序列基因的克隆，尤其是SMART RACE技術更為人們所青睞。本文總結了我們實驗室用SMART RACE技術克隆基因的一些心得體會，希望對用RACE方法克隆基因的同行有些幫助。關鍵詞： RACE; RNA提取;
全基因合成和PCR克隆特點對比？
PCR克隆需要提取表達基因的組織或細胞的RNA，反轉錄為cDNA，再從cDNA擴增出目的基因。獲得的目的基因不大容易做序列上的修改，任何突變體都必須通過后續的突變步驟得到。密碼子優化就更不可能了。PCR克隆的另一個重大局限是對表達豐度低的基因、表達時間極短的基因等特殊基因難以成功克隆。比較而言，全基
pcR擴增中第幾輪能獲得目的基因
PCR擴增過程中產物是按2的n次方方式增加的。因而，只要知道你的起始模板量以及最終想得到的產物量，就可以計算出需要多少個擴增循環了。例如：初始模板：10000個分子目的基因的長度：1 kb則擴增20個循環后理論上就可得到 10 ng的產物（大約100萬個分子）。你若需要更多產物，則需要增加循環數。
pcR擴增中第幾輪能獲得目的基因
至少要第三輪才會出現目的基因。
PCR產物克隆
PCR克隆主要有TA克隆法, 限制性酶切與連接法，雜交法和近期開發出來的特異性重組法等。但因為TA克隆法操作最簡單，快速和高效的原因，成為Taq聚合酶PCR產物的最佳克隆方法。TA克隆法由Invitrogen發明，并擁有全球TA Cloning商標的ZL權。TA克隆方法（Original TA Cl
PCR產物克隆
克隆方法：1. 平端連接? 通常情況下，PCR產物可直接與平端載體DNA進行連接，但其連接效率效低。因為TaqDNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉移酶活性，能在兩6條DNA鏈的3''''末端加上一個多余的堿基，使合成的PCR產物成為3'''&#