qPCR常見異常曲線實戰分析（二）
圖九：試劑蒸發引起擴增曲線抬升4確定實驗過程中的操作細節如果以上都正常，還要確定下實驗過程中的操作細節。比如在做標準曲線的時候是否是梯度稀釋的標準品，如果不是梯度稀釋標準品，可能會引起標準曲線擴增效率或者R2值異常；從冰箱冷凍中取出的試劑是否有混勻，如果試劑融化后沒有混勻，這時候取出的試劑不是均一的，會影響后面的擴增；定量PCR預混液跟核酸模板加好后是否混勻，如果沒有混勻，特別是樣本體積比較大的時候（超過PCR體系的20%），更容易發生optical mixing現象。因為樣本是水相會在上層，試劑（含有甘油成分）會在下層，在前期的PCR過程中不足以混勻完全，這樣會形成折射，熒光較強，而一般加熱幾個循環后樣本跟預混液會混勻，熒光就變穩定了（圖十）。圖十：樣本跟預混液未混勻現象還有上機的反應體系里盡量不要有大的氣泡，有氣泡的話，中間容易形成折射，干擾熒光的采集（圖十一）。所以實時熒光定量PCR實驗的細節還是要特別注意的。圖十一：反應......閱讀全文
qPCR常見異常曲線實戰分析－（二）
圖九：試劑蒸發引起擴增曲線抬升4確定實驗過程中的操作細節如果以上都正常，還要確定下實驗過程中的操作細節。比如在做標準曲線的時候是否是梯度稀釋的標準品，如果不是梯度稀釋標準品，可能會引起標準曲線擴增效率或者R2值異常；從冰箱冷凍中取出的試劑是否有混勻，如果試劑融化后沒有混勻，這時候取出的試劑不是均一的
qPCR常見異常曲線實戰分析－（一）
1確認軟件設置是否正確對照試劑盒說明書，檢查時間、溫度、循環數、熒光采集等是否設置正確。有一個比較容易忽略的設置問題是，需要看下所選用的試劑中是否含有ROX來作為參比熒光染料。2確定耗材及配件是否使用正確? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??耗材對于熒光定量PCR來說比較重要，很多
PCR異常擴增曲線分析攻略（二）
2）未選擇跟儀器加熱模塊規格匹配的耗材目前Applied BiosystemsTM系列熒光定量PCR 儀加熱模塊分0.2ml跟0.1ml兩種，實驗前一定要確定自己的儀器是哪一種加熱模塊，再來選擇對應的耗材。如果0.1ml加熱模塊用成0.2ml耗材，則會造成耗材壓扁，甚至造成機器故障；如果0.
QPCR常見問題及其分析
一般來講，進行real-time qPCR MasterMix都是2×的濃縮液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR靈敏度高，所以每個樣品至少要做3個平行孔，以防在后面的數據分析中，由于Ct相差較多或者SD太大，無法進行統計分析。通常來講，反應體系的引物終濃度為10
QPCR常見問題及其分析
一般來講，進行real-time qPCR MasterMix都是2×的濃縮液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR靈敏度高，所以每個樣品至少要做3個平行孔，以防在后面的數據分析中，由于Ct相差較多或者SD太大，無法進行統計分析。通常來講，反應體系的引物終濃度為100-400
QPCR常見問題及其分析
一般來講，進行real-time qPCR?MasterMix都是2×的濃縮液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR靈敏度高，所以每個樣品至少要做3個平行孔，以防在后面的數據分析中，由于Ct相差較多或者SD太大，無法進行統計分析。通常來講，反應體系的引物終濃度為100-400
QPCR常見問題及其分析
一般來講，進行real-time qPCR MasterMix都是2×的濃縮液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR靈敏度高，所以每個樣品至少要做3個平行孔，以防在后面的數據分析中，由于Ct相差較多或者SD太大，無法進行統計分析。通常來講，反應體系的引物終濃
qPCR擴增曲線的自述
擴增曲線，來自熒光定量PCR，是用于描述qPCR動態進程的曲線，我有兩種形態，一種是線性圖譜：橫坐標是循環數，縱坐標是熒光強度值；另一種是對數圖譜：橫坐標是循環數，縱坐標是熒光強度值的對數。大家根據我來確定Cq值，最終確定初始模板的含量。新冠疫情以來，我可是發揮了重要的作用，診斷技術的金標準，驕傲的
qPCR溶解曲線TM值
tm>80℃隨溫度升高，DNA的雙螺旋結構降解程度的曲線。全部DNA雙螺旋結構降解一半的溫度稱為溶解溫度（Tm）。不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G－C含量越高，Tm值越高，成正比關系。不排除極度偶然的情況：1.兩個序列的溶解曲線一樣 2.沒有目標產物，只有一種非特異產物。
qPCR溶解曲線TM值
tm>80℃_芙馇叻治隹梢雜美慈范ú煌姆從Σ錚ǚ翹匾煨圓鎩?_芙馇?(Dissociation curve)：隨溫度升高，DNA的雙螺旋結構降解程度的曲線。全部DNA雙螺旋結構降解一半的溫度稱為溶解溫度（Tm）。不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G－C含量越高，Tm值越高，成正比關系。不排除極度
qPCR擴增曲線的自述
我是擴增曲線，來自熒光定量PCR，是用于描述qPCR動態進程的曲線，我有兩種形態，一種是線性圖譜：橫坐標是循環數，縱坐標是熒光強度值；另一種是對數圖譜：橫坐標是循環數，縱坐標是熒光強度值的對數。大家根據我來確定Cq值，最終確定初始模板的含量。新冠疫情以來，我可是發揮了重要的作用，診斷技術的金標準，驕
PCR異常擴增曲線分析攻略（一）
近幾年，從科學研究到臨床檢測，從“非洲豬瘟”檢測到“新冠病毒”檢測，熒光定量PCR儀器已成為分子生物學研究的常規設備。檢測方法的迅速發展，檢測任務的緊急也對檢測人員提出了更高的要求，需要他們具備熟練判斷數據結果的能力。對于熒光定量PCR的結果的判斷，最直觀的判斷就是看擴增曲線是否正常。很多老師在平時
如何作QPCR的標準曲線
作QPCR的標準曲線可以用PCR－ELISA法作。具體如下：PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合；再加入抗地高辛或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結合物，最終酶使底物顯色。常規的PCR－ELISA法只是定性實驗，加入內標，作出標準曲線，也可實現定量檢測
如何作QPCR的標準曲線
作QPCR的標準曲線可以用PCR－ELISA法作。具體如下：PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合；再加入抗地高辛或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結合物，最終酶使底物顯色。常規的PCR－ELISA法只是定性實驗，加入內標，作出標準曲線，也可實現定量檢測
如何作QPCR的標準曲線
作QPCR的標準曲線可以用PCR－ELISA法作。具體如下：PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合；再加入抗地高辛或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結合物，最終酶使底物顯色。常規的PCR－ELISA法只是定性實驗，加入內標，作出標準曲線，也可實現定量檢測
如何作QPCR的標準曲線
作QPCR的標準曲線可以用PCR－ELISA法作。具體如下：PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合；再加入抗地高辛或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結合物，最終酶使底物顯色。常規的PCR－ELISA法只是定性實驗，加入內標，作出標準曲線，也可實現定量檢測
如何作QPCR的標準曲線
作QPCR的標準曲線可以用PCR－ELISA法作。具體如下：PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合；再加入抗地高辛或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結合物，最終酶使底物顯色。常規的PCR－ELISA法只是定性實驗，加入內標，作出標準曲線，也可實現定量檢測
如何作QPCR的標準曲線
作QPCR的標準曲線可以用PCR－ELISA法作。具體如下：PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合；再加入抗地高辛或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結合物，最終酶使底物顯色。常規的PCR－ELISA法只是定性實驗，加入內標，作出標準曲線，也可實現定量檢測
如何作QPCR的標準曲線
作QPCR的標準曲線可以用PCR－ELISA法作。具體如下：PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合；再加入抗地高辛或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結合物，最終酶使底物顯色。常規的PCR－ELISA法只是定性實驗，加入內標，作出標準曲線，也可實現定量檢測
同科生物qPCR常見問題及分析
通常來講，real-time qPCR的反應程序不需要像常規的PCR那樣，要變性、退火、延伸3步。由于其產物長度在80～150 bp之間，所以只需要變性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，zui好在PCR擴增程序結束后，加一個溶解程序，來形成溶解曲線，判斷PCR產物的特異性擴增。而溶解程序
同科生物qPCR常見問題及分析
通常來講，real-time qPCR的反應程序不需要像常規的PCR那樣，要變性、退火、延伸3步。由于其產物長度在80～150 bp之間，所以只需要變性和退火就可以了。 SYBR@Green等染料法，zui好在PCR擴增程序結束后，加一個溶解程序，來形成溶解曲線，判斷PCR產物
熒光定量PCR異常擴增曲線分析攻略
近幾年，從科學研究到臨床檢測，從“非洲豬瘟”檢測到“新冠病毒”檢測，熒光定量PCR儀器已成為分子生物學研究的常規設備。檢測方法的迅速發展，檢測任務的緊急也對檢測人員提出了更高的要求，需要他們具備熟練判斷數據結果的能力。對于熒光定量PCR的結果的判斷，最直觀的判斷就是看擴增曲線是否正常。很多老師在平時
擴增曲線異常問題
參比染料設定不正確：MasterMix 不加參比染料時，選 NONE。 模板的濃度太高或者降解。 熒光染料的降解。??
PCR異常曲線解析
在PCR實驗過程中，我們經常會遇到各種奇特的擴增曲線，如何正確解讀這些曲線并且做出恰當的解決方案是我們一線實驗者需要練就的基本功。今兒，小編將多年累積的功力編成“武功秘籍”奉上，助你PK掉那些令人犯暈的異常曲線。異常曲線1：PCR擴增抑制原因分析：H07存在擴增抑制解決方案：將樣本稀釋后進行擴增（抑
qPCR常見問題及其分析解決方法
常見問題 1. 無Ct值出現 檢測熒光信號的步驟有誤: 一般SG法采用72℃延伸時采集，Taqman法則一般在退火結束時或延伸結束采集信號。 引物或探針降解: 可通過PAGE電泳檢測其完整性。 模板量不足: 對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。 模板降解: 避免樣品制備中雜
qPCR的溶解曲線有多個峰值
溶解曲線有多個峰值就說明有非特異性擴增。可以升高退火溫度,或者更換引物。
qPCR的溶解曲線有多個峰值
溶解曲線有多個峰值就說明有非特異性擴增。可以升高退火溫度,或者更換引物。
qPCR的溶解曲線有多個峰值
溶解曲線有多個峰值就說明有非特異性擴增。可以升高退火溫度,或者更換引物。
qPCR的溶解曲線有多個峰值
溶解曲線有多個峰值就說明有非特異性擴增。可以升高退火溫度,或者更換引物。
qpcr不做溶解曲線可以嗎
沒有溶解曲線說明對應的pcr管中沒有產物。qpcr的溶解曲線就是對應孔內pcr產物對應的tm值。如果一個孔沒有溶解曲線說明這個孔中沒有產物，沒有產物的原因有很多種，例如：pcr反應體系中可能沒有加模板或者加酶或者引物等，少一個成分都會導致相應的孔沒有溶解曲線，也有可能是。