RTPCR技術的簡介
RT—PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）是將RNA的反轉錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。首先經反轉錄酶的作用，從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，在DNA聚合酶作用下擴增合成目的片段。RT—PCR技術靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞中基因表達水平、細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉錄的RNA產物。無論使用何種RNA，關鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。用于反轉錄的引物可視實驗的具體情況選擇隨機引物、Oligo dT及基因特異性引物中的一種。對于短的不具有發夾結構的真核細胞mRNA，3種都可。......閱讀全文
RTPCR技術的簡介
RT -PCR首先經反轉錄酶的作用以RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。RT-PCR技術靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞中基因表達水平、細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉錄的RNA產物。無論使用何種RN
RTPCR技術的簡介
RT—PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）是將RNA的反轉錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。首先經反轉錄酶的作用，從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，在DNA聚合酶作用下擴增合成目的片段。RT—PCR
RTPCR技術簡介和RTPCR引物的選擇
RT-PCR簡介RT-PCR是將RNA的反轉錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。首先經反轉錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。RT-PCR技術靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cD
RTPCR技術的定義
RT-PCR，反轉錄·聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）是將RNA的反轉錄（reverse transcription ）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。
RTPCR技術1
目前已有多種方法用來研究有關細胞和組織中，基因表達產物方面的內容，這些方法主要有Northern印跡、RNase保護分析法、原位雜交、點印跡、Ｓ１核酸酶分析法及反轉錄與PCR擴增串聯的RT-PCR技術等。在這些方法中RT-PCR技術具敏感度高和應用范圍廣的特點，該技術提供給研究人員有效的進行測定轉錄
RTPCR技術2
三：操作１：反轉錄反應按下表準備反應液樣品 體積 終濃度５×反應緩沖液 10μl １×dNTP混合液 1μl 0.2mM下游引物 50pmol* 1μm上游引物 50pmol* 1μm25mM MgSO4 2μL 1mMAMV反轉錄酶 1μl 0.1μ/μlTflDNA聚合酶 1μl 0.1μ/μl
RTPCR技術的操作步驟
1、從RNA（或mRNA）反轉錄合成cDNA第一鏈：2、于95℃加熱5～10min，滅活反轉錄酶，使RNA—cDNA雜交體變性，然后迅速冰浴冷卻：3、PCR擴增：方法基本同PCR。cDNA第一鏈合成方法：20ul反應液中含10xPCR擴增緩沖液，2ul；四種dNTP（10 mmol/L）2ul；RN
RTPCR技術的影響因素
（一）組織或細胞樣本不是每種組織或細胞都表達所有的基因，即某些基因的mRNA不存在于某些組織或細胞中。因此，確定所選用的材料中是否含有需擴增的目標mRNA模板是實驗成敗的關鍵。（二）引物合成cDNA第一條鏈時，引物可用隨機6聚核苷酸，或下游引物，或poly（dT），其中以6聚核苷酸的隨機引物效果最好
RTPCR技術的注意事項
1、合成cDNA的引物：合成cDNA引物時，通常采用隨機六核苷酸引物能夠有效地指導從RNA有效地合成第一鏈cDNA：2、避免RNA酶的污染：在合成cDNA第一鏈時，應使用RNA酶抑制劑，進行RT-PCR時，用于合成cDNA第一鏈的RNA不會對PCR有影響，因此沒有必要用堿或RNA酶處理；3、不同來源
RTPCR原理與實驗技術
一、知識背景：1. 基因表達：DNA——RNA——Protein單拷貝基因表達存在逐步放大機制，如一個蠶絲心蛋白基因——104個絲心蛋白mRNA（每個mRNA存活4d，可以合成105個絲心蛋白）——共合成109個絲心蛋白 。因此單拷貝基因的mRNA表達水平對于其功能水平的調控是非常重要的。2.?PC
RTPCR的指數擴增的技術原理
? RT-PCR的指數擴增是一種很靈敏的技術，可以檢測很低拷貝數的RNA。RT-PCR廣泛應用于遺傳病的診斷，并且可以用于定量監測某種RNA的含量。? RT-PCR的關鍵步驟是在RNA的反轉錄，要求RNA模版為完整的且不含DNA、蛋白質等雜質。在完成逆轉錄過程之后,通過PCR進行定量分析的時候，隨著
RTPCR技術的進行過程及方法
RT-PCR可以用一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進行。cDNA的合成首先在反轉錄RT-PCR可以用一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進行。cDNA的合成首先在反轉錄緩沖液中進行，然后取出1/10的反應產物進行PCR。在一步法
RTPCR技術的定義和檢測方法
? ?1.定義：是以RNA為模板，聯合逆轉錄反應（reverse transcription，RT）與PCR，可用于檢測單個細胞或少數細胞中少于10個拷貝的RNA 模板。 RNA擴增包括兩個步驟：在單引物的介導下和逆轉錄酶的催化下，合成RNA的互補cDNA；加熱后cDNA與RNA鏈解離，然后與另一引
microRNA的實時定量莖環RTPCR技術
microRNA的實時定量莖環RT-PCR技術 摘要： 已開發出一種新型的microRNA（miRNA）的定量方法，即利用莖環反轉錄，Taqman PCR分析。莖環RT引物在RT 效率和特異性方面比傳統的更好。TaqMan miRNA的檢測是很具體的，可以檢測成熟miRNA和區分
RNA－提取策略及RT－PCR技術
第一部分RNA 提取策略1、RNA降解的原因內源性RNAase是造成RNA降解的最重要原因，因為人體細胞自身就是幾十分鐘（20min？）mRNA被降解一輪，所以不管是組織還是細胞還是液體狀樣本在離開其中細胞的最佳生活狀態后都應該盡快的被妥善的方法保存起來。外源性RNA酶也是一個需要注意的因素，最常見
RTPCR技術檢測豬流感病毒
?根據豬流感病毒siv的M 基因的序列，設計合成了1對引物，建立了檢測豬流感的RT-PCR方法。應用該方法對Hl、H3、H9亞型的豬流感病毒進行基因擴增，均獲得了分子量為460bp的特異性目的片段，而對PRRSV、PCV2、PI 、CSFV進行同條件檢測，結果均為陰性；SIV擴增產物測序結果與SIV
定量RTPCR－（Quantitative－RTPCR）
Application:?Quantitative RT-PCR?is used to quantify mRNA in both relative and absolute terms. It can be applied for the quantification of mRNA expres
microRNA的實時定量莖環RTPCR技術（三）
評估RNA分離的需要，我們直接在miRNA的檢測中增加了細胞裂解物。相當于直接在7.5毫升逆轉錄反應中添加2.5-2500細胞。當檢測到，在一些細胞中CT值相關R2>0.998）的RT反應至少有三個數量級（圖4）。?圖3。總RNA輸入的閾值循環（CT）值檢測8個miRNA的相關性。每RT反應中，小鼠
microRNA的實時定量莖環RTPCR技術（二）
圖1。上圖描述的是TaqMan miRNA的檢測原理，基于TaqMan實時定量miRNA的包括兩個步驟，莖環RT和實時PCR。莖環RT引物結合在miRNA分子的3'端和用反轉錄酶逆轉錄。然后，RT產品使用傳統的TaqMan PCR定量，其中包括特定miRNA的正向引物，反向引物和
microRNA的實時定量莖環RTPCR技術（一）
摘要：已開發出一種新型的microRNA（miRNA）的定量方法，即利用莖環反轉錄，Taqman PCR分析。莖環RT引物在RT 效率和特異性方面比傳統的更好。TaqMan miRNA的檢測是很具體的，可以檢測成熟miRNA和區分相關的甚至低至一個核苷酸的miRNAs。此外，他們不會受到基因組DNA
microRNA的實時定量莖環RTPCR技術（四）
?圖5。對熱處理細胞，細胞裂解液和10 miRNA實時定量總RNA進行比較。用閾值循環（CT）來衡量miRNA的表達水平。每PCR擴增約400 HepG2細胞進行了分析。??圖6。的TaqMan miRNAmiR-16的分析比較來解決以印跡雜交為基礎的分析。總RNA來自小鼠腎，肝，肺，脾和睪丸組織。
microRNA的實時定量莖環RTPCR技術（五）
TaqMan miRNA的檢測能力不同，是依據采用let-7a, let-7b, let-7c, let-7d 和let-7e 5個合成miRNA來檢測低至一個核苷酸（圖7）。每個miRNA的檢測對應每個miRNA。相對探測效率是通過計完全匹配和不匹配的目標CT之間的差異，假設完美匹配的效率為1
RT－PCR技術及RNA提取策略3
成功的RT PCR的要素1、高質量RNA 成功的cDNA合成來自高質量的RNA。高質量的RNA至少應保證全長并且不含逆轉錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。RNA的質量決定了你能夠轉錄到 cDNA上的序列信息量的最大值。一般不必使用oligo（dT）選擇性分離poly（A）+RNA。不管起始模
RT－PCR技術及RNA提取策略1
第一部分 RNA 提取策略1、RNA降解的原因內源性RNAase是造成RNA降解的最重要原因，因為人體細胞自身就是幾十分鐘（20min？）mRNA被降解一輪，所以不管是組織還是細胞還是液體狀樣本在離開其中細胞的最佳生活狀態后都應該盡快的被妥善的方法保存起來。外源性RNA酶也是一個需要注意的因素，最常
RT－PCR技術及RNA提取策略2
一般的瓊脂糖凝膠電泳，注意不要用甲醛變性電泳（又不是做northern，實在沒有必要）。電泳槽注意一定不要用DEPC處理，一定要保證電泳體系中有少量的RNAase存在。分別在加樣孔中加入1，2，3μlRNA抽提溶液。在旁邊加入DNA marker。1%瓊脂糖凝膠，10V/cm的電壓，電泳10
RTPCR的原理
原理是：提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。該技術主要用于：分析基因的轉錄產物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構建RNA高效轉錄系統。RT- PCR（Re
什么是RTPCR，RTPCR的定義與檢測方法？
1.定義：是以RNA為模板，聯合逆轉錄反應（reverse transcription，RT）與PCR，可用于檢測單個細胞或少數細胞中少于10個拷貝的RNA模板。?RNA擴增包括兩個步驟： 在單引物的介導下和逆轉錄酶的催化下，合成RNA的互補cDNA；加熱后cDNA與RNA鏈解離，然后與另一引物退火
半定量RTPCR－（SemiQuantitative－RTPCR－）
RT-PCR?AnalysisSolutions10X RT Buffer10X?PCR?Buffer100 mM Tris pH 9.0500 mM KCl1% Triton X-10025 mM MgCl2use at a concentration of 1.5 mMLysis Solutio
RTPCR－PROTOCOL
RT-PCR PROTOCOL材料與方法…………………………………………………………????1．材料?………………………………………………………1.1?供試用組織(細胞)…………………………………1.2?主要儀器設備………………………………………1.3?主要試劑……………………………………………1.
RTPCR步驟
總RNA提取1. 取200mg組織，放到1.5ml EP管中，加入1ml Trizol剪碎。2. 震蕩30s。3. 加0.2ml氯仿，劇烈搖動30s，室溫3min。4. 12000×g，4℃ 離心，15min。5. 吸上層無色水相，移入另一EP管中（約0.5ml）。6. 加等體積異丙醇，-20℃，3