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Buffers for His purification in denatured conditions: 配制時加終體積50％的水，之后定容至所需體積。先配pH 8.0的buffer(調pH需要較多NaOH)，再統一配bufferC，D，E，分別調pH Buffer B (200ml): 100 mM NaH2PO4 3.12 g NaH2PO4·2H2O (MW 156 g/mol) 10 mM Tris·Cl 0.24g Tris base (MW 121.1 g/mol) 8 M urea &......閱讀全文
重組蛋白是研究生物學過程的重要工具。需要使用表達系統來對其進行制備。合適表達系統的選擇取決于重組蛋白的特性、重組蛋白的預期應用以及該系統能否生產足夠量的蛋白質。作者： 伯吉斯等,主譯：陳薇，本實驗來自「蛋白質純化指南」實驗步驟一、引言選 擇 合 適 醜 組 蛋 白 表 達 方 法 對 于 能 否 及
類似方案 1、方案 2 描述了在真核表達載體上進行 cDNA 文庫構建與篩選的方法, 流程分為以下兩個階段：1. 在真核表達載體上構建 cDNA 文庫；2. 在真核表達載體上構建的 cDNA 文庫的篩選。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）上冊，作者：黃培堂。實驗材料宿主細胞質粒或λ噬菌體表達載體
在生命科學領域，沒有一本書比它更紅，幾乎每個實驗室都有，幾乎每個人都翻過。它就是《分子克隆實驗指南》。30年前，這本書誕生于冷泉港實驗室出版社，它的前身是1980年冷泉港真核基因分子克隆講習班實驗方案的匯編。7年后，該書又出了第二版。當時的人們也許未曾料到，這部著作在20年的時間里竟成為指導生命
Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。 本文主要通過以下幾個方面來詳細地介紹一下Western Blot技術: 一、原理 二、分類
Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。一、原理與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被
本方案將在疑難解析和誘導啟動子表達蛋白的優化部分討論影響質粒表達效率的因素。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布魯克 D.W. 拉塞爾。實驗材料帶有 lacIq 或 lacIq1 等位基因的適于轉化的大腸桿菌菌株IPTG 誘導的表達載體試劑、試劑盒考馬斯亮藍染色溶液或
本實驗介紹關于用堿性磷酸酶啟動子（phoA) 和信號序列在大腸桿菌中分泌表達外源蛋白的過程。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布魯克 D.W. 拉塞爾。實驗材料大腸桿菌菌株pTA1529 或 pBAce陽性對照質粒試劑、試劑盒考馬斯亮藍染色溶液或銀染溶液微量營養MOP
多聚組氨酸能與多種過渡金屬和過渡金屬螯合物結合，因此帶暴露的 His-6 的蛋白能結合于固化 Ni2+樹脂，用適當緩沖液沖洗去除其他蛋白后，再用可溶的競爭性螯合劑洗脫可以回收靶蛋白。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布魯克 D.W. 拉塞爾。實驗材料表達帶多聚組氨酸標
λ噬菌體 PL 啟動子是受控于溫度敏感阻抑物（cIts857) 的強效啟動子，阻抑物可在低溫下阻抑 PL 啟動子的轉錄，但在髙溫下不能。因此帶有λ噬菌體啟動子的載體必須以帶有 cIts857 基因的菌株作為宿主。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布
實驗方法原理 蛋白質在大腸桿菌中的高水平表達，常常導致形成相差顯微鏡下可見的細胞質顆粒或包涵體。這些由表達蛋白聚集成的包涵體很容易與可溶性蛋白和膜結合蛋白分離。高水平表達外源蛋白的細
RNA干擾載體主要用來研究基因表達調控，RNA干擾技術已已被廣泛用于基因結構功能研究和傳染性疾病及基因治療領域，進行RNA干擾實驗首先是構建RNA干擾載體，本文以pRI系列載體為例論述了干擾載體的構建的實驗流程。產品技術背景pRI系列載體是基于III類rna聚合酶啟動子：人類H1啟動子的專用于哺乳動
產品技術背景pRI系列載體是基于III類RNA聚合酶啟動子：人類H1啟動子的專用于哺乳動物細胞RNA干擾的載體。H1啟動子在哺乳動物細胞內合成類似siRNA分子的小分子RNA。由于H1啟動子有精確的轉錄起始位點和終止信號，H1啟動子轉錄產物精確生成人工設計的shRNA，shRNA經過RISC剪切后形
實驗方法原理蛋白質在大腸桿菌中的高水平表達，常常導致形成相差顯微鏡下可見的細胞質顆粒或包涵體。這些由表達蛋白聚集成的包涵體很容易與可溶性蛋白和膜結合蛋白分離。高水平表達外源蛋白的細菌經離心濃縮后，可通過機械法、超聲處理法或溶菌酶加去污劑的方法進行裂解。包涵體經離心沉淀后，可用Triton X-100
產品技術背景pRI系列載體是基于III類RNA聚合酶啟動子：人類H1啟動子的專用于哺乳動物細胞RNA干擾的載體。H1啟動子在哺乳動物細胞內合成類似siRNA分子的小分子RNA。由于H1啟動子有精確的轉錄起始位點和終止信號，H1啟動子轉錄產物精確生成人工設計的shRNA，shRNA經過RISC剪切后形
Tabor 和 Richardson 在 1985 年及 Studier 和 Moffatt 在 1986 年提出了一個新的利用 T7 噬菌體啟動子的表達系統，使用的是從 T7 噬菌體基因組獲得的轉錄信號。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布魯克 D.W. 拉塞爾。實
下面的方案分成 3 個階段：用 pTet-tTAk 穩定轉染成纖維細胞，穩定轉染可誘導表達 tTA 的 NIH-3T3 細胞，分析轉染細胞中的蛋白表達。穩定轉染細胞系表達反式激活因子和靶基因分為兩個階段。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布魯克 D.W. 拉塞爾。實驗
在典型的免疫篩選實驗中，λ噬菌體表達載體構建的文庫應鋪在不含異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG) 的大腸桿菌菌株的平板上。誘導物的缺少保證了噬菌斑順利形成前不產生對宿主有毒性的融合蛋白，2~4 h 后，將平板從 42°C 移到 37°C 以穩定溫度敏感型的所有融合蛋白。本實驗來源于分子克隆實驗指
實驗概要免疫印跡是一個用于蛋白質分析的常規技術，在電場的作用下將電泳分離的蛋白從凝膠轉移至一種固相支持物，然后利用抗原—抗體的特異性反應，從蛋白混合物中檢測出目標蛋白，從而定量或定性地確定正常或實驗條件下細胞或組織中目標蛋白的表達情況。Western blot還可用于蛋白—蛋白、蛋白—DNA
綠色熒光融合蛋白表達載體的構建 綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP) 及其突變體能在各種不同的生物系統中表達，這對細胞生物學的研究具有重要意義。而熒光蛋白的折疊能力及其同細胞內蛋白的融合能力，使研究 者能直接在細胞體內觀察到蛋白質的
用固化 Ni2+吸收色譜純化帶組氨酸標簽的蛋白實驗 實驗材料 表達帶多聚組氨酸
檢測結合抗體的方法有以下 3 種：放射化學篩選，生色反應篩選及化學發光反應篩選。3 種方法的優缺點在本章導言中有所論述。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布魯克 D.W. 拉塞爾。試劑、試劑盒封閉緩沖液氯仿裂解緩沖液檢測抗原-抗體復合物所用試劑SMTNT 緩沖液洗滌緩
細菌克隆的溶解實驗可以用于：（1）從表達特定融合蛋白質的重組噬菌體構建噬菌體溶源菌；（2）從該溶源菌誘導合成并純化出融合的目的蛋白質。實驗方法原理具有原噬菌體的細菌稱為溶原性細菌。噬菌體分為烈性噬菌體和溶原性噬菌體，在感染于寄主細菌細胞時，前者往往在菌體內增殖并將菌體裂解。實驗材料大腸桿菌噬菌體試劑
pGEX 載體表達的外源蛋白與谷胱甘肽 S 轉移酶融合，因此可以通過谷胱甘肽-瓊脂糖親和層析進行純化。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布魯克 D.W. 拉塞爾。實驗材料表達 GST 融合蛋白的大腸桿菌細胞試劑、試劑盒二硫蘇糖醇谷胱甘肽洗脫緩沖液磷酸緩沖鈉鹽溶液Tri
可利用合成雙鏈寡核苷酸篩選構建于λ噬菌體的 cDNA 表達文庫，以鑒定與特異 DNA 結合蛋白質相對應的克隆（Singhetal.1988,Vinsonetal.1988)。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布魯克 D.W. 拉塞爾。試劑、試劑盒ATP結合緩沖液變性溶
我們將方案分成三個階段: 第一階段介紹蛋白質的制備及蛋白質的熒光染料標記；第二階段，通過轉染或微注射將適當的探針成分導入細胞；第三階段，圖像的收集和分析過程。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布魯克 D.W. 拉塞爾。實驗材料進行轉染的細胞株按第二階段所介紹的方法制備
本方法適用于對可免疫檢測的融合蛋白進行快速篩選λgtll 重組噬菌體。但在其他條件下（如：對感染率的優化，42°C λ噬菌體基因的失活及裂解前收集)，此方法亦可用于產生制備量的融合蛋白 (Runge1992)。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布魯克 D.W. 拉塞爾
電穿孔可以有效地轉染磷酸鈣-DNA 沉淀物等其他方法轉染效果不好的細胞系。但是，與其他轉染方法一樣，未使用過的細胞系進行電穿孔轉染的實驗條件要經過優化。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布魯克 D.W. 拉塞爾。實驗材料指數生長的哺乳動物細胞培養液試劑、試劑盒Giem
下面是拫據 Horch 等（1999)、Sanford 等（1993)、主要基因槍生產商的出版物（US/EG Bulletins 1688 and 2087;Bio-Rad) 以及 Steve Finkbeiner(University of California,San Francisco) 建立
細菌克隆的溶解實驗 實驗方法原理 具有原噬菌體的細菌稱為溶原性細菌。噬菌體分為烈性噬菌體和溶原性噬
Jay Haron Ph. D. jay.haron@gmail.com BD Biosciences, San Diego, United States 引用 實驗材料和方法 從1968年最