含有目的基因真核表達pEGFPC1載體的構建實驗_轉化
實驗方法原理轉化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統缺陷的變異株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變體（Rˉ，Mˉ），它可以容忍外源DNA分子進入體內并穩定地遺傳給后代。受體細胞經過一些特殊方法（如電擊法，CaCl2）處理后，細胞膜的通透性發生了暫時性的改變，成為能允許外源DNA分子進入的感受態細胞（Competentcells）。進入受體細胞的DNA分子通過復制，表達實現遺傳信息的轉移，使受體細胞出現新的遺傳性狀。將經過轉化后的細胞在篩選培養基中培養，即可篩選出轉化子（Transformant），即帶有異源DNA分子的受體細胞）。實驗材料重組質粒試劑、試劑盒SOC液體培養基LB 液體培養基JM109DH5 αAmpKan儀器、耗材LB平板實驗步驟1. 100 ul感受態細胞在冰中融化。 2. 分裝2管，50 ul/管。 3. 加入轉化的DNA Xul。 4. &......閱讀全文
含有目的基因真核表達－pEGFPC1載體的構建實驗_轉化
實驗方法原理轉化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統缺陷的變異株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變體（Rˉ，Mˉ），它可以容忍外源DNA分子進入體內并穩定地遺傳給后代。受體細胞經過一些特殊方法（如電擊法，CaCl2）處理后，細胞膜的通透性發生了暫時性的改變，成為能允許外源DNA分子進入的感受態細胞
含有目的基因真核表達－pEGFPC1載體的構建實驗_克隆法
實驗方法原理在設計引物時,一對引物兩端分別加了兩個酶切位點,這兩個酶切位點與pEGFP-C1 載體多克隆位點中的酶切位點相吻合,且位置和方向都合適。這樣, 目的基因片段和pEGFP-C1 載體經雙酶切后,由于酶切位點一致,在T4 DNA 連接酶的作用下就可以連接。實驗材料DNA 片段試劑、試劑盒pE
含有目的基因真核表達－pEGFPC1載體的構建實驗_質粒提取
試劑、試劑盒質粒提取試劑盒限制性核酸內切酶儀器、耗材離心機振蕩培養箱電泳裝置冰盒恒溫水浴箱實驗步驟1. ?挑取含有目的DNA重組體的單個菌落接種在3 ml LB（含有Amp或Kan）液體培養基中，37 ℃，225 rpm培養12～16 hrs。?2. ?提取質粒?⑴離心菌液，廢棄上清。?⑵加入250
含有目的基因真核表達－pEGFPC1載體的構建實驗_PCR擴增法
實驗方法原理以DNA為模板，在4種核苷酸存在的條件下，借助DNA聚合酶作用出現的酶促合成，依賴于在加熱條件下，雙鏈DNA解離成單鏈（變性），降溫（復性），使引物與單鏈特異性結合，同時使4種核苷酸在DNA聚合酶的作用下，發生以引物為起點進行聚合的現象，使DNA鏈不斷延伸，PCR反應進行。反應步驟包括：
真核基因表達載體的構建
提高目的基因在哺乳動物細胞中表達的策略：1、DNA水平：增加基因拷貝數(1)高拷貝載體；（2）基因共擴增；2、轉錄水平：利用強啟動子、增強子，可誘導啟動子，如CMV、Tet；3、翻譯水平：優化翻譯起始序列和非編碼區序列。本篇文章來源于網絡，如有異議請聯系我們，我們將在3個工作日內作出處理。
真核表達載體pcDNA3.1GFP的構建
【原理】引物中設計入限制酶位點：由于PCR引物的5'末端可以增加一些非互補堿基，因此可以在兩引物的5'末端設計單限制酶或雙限制酶切位點。這樣得到的PCR產物用限制酶消化產生粘性末端，即可與有互補粘端的載體DNA重組。這種克隆方法效率較高，且當兩引物中設計不同酶切位點時，可有效地定向克
Tec真核表達載體構建及其對細胞信號的影響實驗
實驗方法原理研究認為Tec有肝組織與造血組織分布特異性，主要與EPO、EGF、IL6、GM CSF等細胞因子介導的信號轉導途徑密切相關，參與調控造血細胞尤其是淋巴細胞的增殖與分化。實驗材料大鼠試劑、試劑盒引物鼠重組肝細胞生長因子DMEM胰酶胎牛血清儀器、耗材PCR儀PVDF實驗步驟一、材料準備1.
Tec真核表達載體構建及其對細胞信號的影響實驗
實驗方法原理研究認為Tec有肝組織與造血組織分布特異性，主要與EPO、EGF、IL6、GM CSF等細胞因子介導的信號轉導途徑密切相關，參與調控造血細胞尤其是淋巴細胞的增殖與分化。實驗材料大鼠 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
真核表達文庫的構建與篩選實驗
類似方案 1、方案 2 描述了在真核表達載體上進行 cDNA 文庫構建與篩選的方法, 流程分為以下兩個階段：1. 在真核表達載體上構建 cDNA 文庫；2. 在真核表達載體上構建的 cDNA 文庫的篩選。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）上冊，作者：黃培堂。實驗材料宿主細胞質粒或λ噬菌體表達載體
真核表達文庫的構建與篩選實驗
? ? ? ? ? ? 實驗材料 宿主細胞 質粒或λ噬菌體表達載體 包裝提取物 電轉化感受態大腸桿菌 試劑、試劑盒
真核表達文庫的構建與篩選實驗
實驗材料 宿主細胞質粒或λ噬菌體表達載體包裝提取物電轉化感受態大腸桿菌試劑、試劑盒 限制性內切核酸酶緩沖液限制性內切核酸酶通過 poly(A)+富集的 mRNAcDNA 文庫含適當抗生素的 Terrific 球脂平板含適當抗生素的 Terrific 肉湯培養基儀器、耗材 cDNA 合成試劑盒實驗步驟
原核表達載體的構建介紹
1、獲得目的基因 （1）通過PCR方法：以含目的基因的克隆質粒為模板，按基因序列設計一對引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點），PCR循環獲得所需基因片段。 （2）通過RT-PCR方法：提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉錄形成cDNA第一鏈，以逆轉錄產物為模板進行PCR循環獲得產物
酵母表達載體的構建與酵母轉化
實驗概要本實驗介紹了酵母表達載體的構建、酵母轉化方法及酵母抗逆實驗。主要試劑試劑配制：1 .1 M Tris.Cl(pH 7.5)(100 ml)：12.1g Tris堿，加80 ml ddH2O，濃HCl調pH 7.5，定容至100 ml；2. 0.5 M EDTA(pH 8.0) (100 ml
目的基因在真核系統中的表達及細胞內的定位實驗
實驗方法原理 將氯化鈣，DNA和磷酸緩沖液混合，形成包含DNA且極小的不溶的磷酸鈣顆粒（沉淀）。磷酸鈣-DNA復合物粘附到細胞膜并通過胞飲進入目的細胞的細胞質。實驗材料 真核細胞試劑、試劑盒 HBSCaCl2TE質粒DNA儀器、耗材 CO2培養箱實驗步驟 1. ?轉染的前一天在35 mm培養皿中植入
真原核基因表達的區別
1、原核生物染色體為一個基因連鎖群，而真核為兩個或以上，當一個有缺陷時另一個可以補充；2、原核生物染色體不與組蛋白結合，省去的解聚的步驟；3、原核生物的轉錄與翻譯都在同一區間，而真核是分開的；4、真核生物基因內有內含子，mRNA會有一個自我剪接的修飾過程，原核生物則不會；5、真核生物蛋白質的翻譯后修
目的基因在真核系統中的表達及細胞內的定位實驗1
磷酸鈣法瞬時轉染法實驗方法原理將氯化鈣，DNA和磷酸緩沖液混合，形成包含DNA且極小的不溶的磷酸鈣顆粒（沉淀）。磷酸鈣-DNA復合物粘附到細胞膜并通過胞飲進入目的細胞的細胞質。實驗材料真核細胞試劑、試劑盒HBSCaCl2TE質粒DNA儀器、耗材CO2培養箱實驗步驟1. ?轉染的前一天在35 mm培養
基因編輯鼠－sgRNA表達載體構建
繼上次發表的Guide RNA設計和篩選的相關知識之后，希望大家還沒有忘記相關的操作和技巧，今天，我們就來和大家聊聊后續的實驗，在基因編輯鼠的過程中，sgRNA表達載體是如何構建的呢？在靶點篩選結束之后，下一步就要進行sgRNA載體構建。在構建表達載體前，應根據實驗目的選取合適的表達質粒。比如進行實
靶向－EGFR基因－siRNA表達載體的構建
實驗材料靶向EGFR基因siRNA試劑、試劑盒pSilencer2.1-U6載體EcoR IBamH IT4 DNA連接酶鼠抗人anti-EGFRFITC標記兔抗小鼠IgGCy3標記兔抗小鼠IgG甘油多聚甲醛二甲基亞砜儀器、耗材流式細胞儀熒光顯微鏡二氧化碳細胞培養箱酶標儀培養板蓋玻片載玻片利用Lip
目的基因在真核系統的表達及細胞內的定位實驗—熒光法
實驗方法原理綠色熒光蛋白（Green fluorecent protein，GFP）最早是在海洋生物水母（Aequorea victoria）中發現的。GFP 蛋白的多肽鏈中含有特殊的生色團結構，可在紫外光源下發出穩定的綠色熒光，而且這種熒光發射無需外加輔助因子或進行任何特殊處理。GFP 標記分子最
RNAi表達載體構建
近年來的研究表明，一些短片斷的雙鏈RNA可以通過促使特定基因的mRNA降解來高效、特異的阻斷體內特定基因表達，誘使細胞表現出特定基因缺失的表型， 稱為RNA干擾（RNA interference，RNAi）。siRNA（small interfering RNAs）就是這種短片斷雙鏈RNA分子，能夠
RNAi表達載體構建
近年來的研究表明,一些短片斷的雙鏈RNA可以通過促使特定基因的mRNA降解來高效、特異的阻斷體內特定基因表達,誘使細胞表現出特定基因缺失的表型, 稱為RNA干擾（RNA interference,RNAi）.siRNA（small interfering RNAs）就是這種短片斷雙鏈RNA分子,能夠
原核表達之目的基因克隆
1. 了解實驗課題對目的蛋白的要求包括：目的蛋白分子量有多大，表達目的（是蛋白結晶、藥劑結合還是制備抗體，不同目的對蛋白要求不同）；是否要其可溶；是胞內表達還是分泌表達，是組成型表達還是誘導型表達；另外，還要了解蛋白表達后需要采用什么樣的方式進行純化，純化標簽有多大，蛋白純化后是否需要將標簽去除（即
siRNA表達載體的構建
siRNA表達載體構建可應用于：（1）作為后基因組時代基因功能分析的有力工具；（2）基因組學、細胞信號傳導通路分析；（3）藥物靶點篩選、疾病治療。實驗方法原理多數的siRNA表達載體依賴三種RNA聚合酶III 啟動子(pol III)中的一種，操縱一段小的發夾RNA(short hairpin RN
siRNA表達載體的構建
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 多數的siRNA表達載體依賴三種RNA聚合酶III 啟動子(pol III)中的一種，操縱一段小的發夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳動物細胞中的表達。這三類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U
siRNA表達載體的構建
實驗方法原理 多數的siRNA表達載體依賴三種RNA聚合酶III 啟動子(pol III)中的一種，操縱一段小的發夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳動物細胞中的表達。這三類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子。之所以采用RNA pol
植物表達載體的構建
實驗概要本實驗介紹了一種構建植物表達載體的方法。實驗步驟1. 植物正義表達載體的構建??? 1) 用SmaI和SacI雙酶切pTriplEx2-GhMT3a和植物表達載體pBI121：??? 2) 進行瓊脂糖凝膠電泳，回收GhMT3a片段和pBI121載體；??? 3) 連接：連接體系為：混勻后4-
瞬時轉染真核基因表達調控技術
調節瞬時轉染基因的表達l??????四環素作為哺乳動物細胞中可誘導基因表達的調控物階段一：pTet-tTAk穩定轉染成纖維細胞培養和轉染細胞1.??????在DMEM完全培養液中培養貼壁細胞。轉染前一天，把細胞換到含有0.5μg/ml四環素-HCl（四環素）的DMEM完全培養液中。每個10 cm培養
瞬時轉染真核基因表達調控技術
調節瞬時轉染基因的表達*四環素作為哺乳動物細胞中可誘導基因表達的調控物階段一：pTet-tTAk穩定轉染成纖維細胞培養和轉染細胞1.?在DMEM完全培養液中培養貼壁細胞。轉染前一天，把細胞換到含有0.5μg/ml四環素-HCl（四環素）的DMEM完全培養液中。每個10 cm培養皿中加入足量細胞，使轉
關于真核生物基因表達調控的介紹
真核生物基因表達調控與原核生物有很大的差異。原核生物同一群體的每個細胞都和外界環境直接接觸，它們主要通過轉錄調控，以開啟或關閉某些基因的表達來適應環境條件（主要是營養水平的變化），故環境因子往往是調控的誘導物。而大多數真核生物，基因表達調控最明顯的特征是能在特定時間和特定的細胞中激活特定的基因，
篩選質粒載體構建表達文庫實驗
檢測結合抗體的方法有以下 3 種：放射化學篩選，生色反應篩選及化學發光反應篩選。3 種方法的優缺點在本章導言中有所論述。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布魯克 D.W. 拉塞爾。試劑、試劑盒封閉緩沖液氯仿裂解緩沖液檢測抗原-抗體復合物所用試劑SMTNT 緩沖液洗滌緩