小鼠心臟組織蛋白樣品的蛋白質組學分析
實驗概要本實驗提供了一個心臟組織2-DE蛋白樣品制備及檢測的流程，為蛋白質雙向電泳實驗做好準備。實驗步驟1. 心臟組織2-DE蛋白樣品的制備 1) 將冷凍的小鼠心臟組織在液氮條件下研磨成粉末； 2) 然后加入5 x體積蛋白裂解液(7 M Urea, 2 M Thiourea, 40 mM Tris, 4 % CHAPS, 65mMDTT, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 5 mM protease inhibitor cocktail, 0.5% Pharmaltes, pH3-10)，用Teflon勻漿器勻漿組織1 min，超聲勻漿30s； 3) 室溫放置10 min，4oC； 4) 14,000 g離心30 min，收集上清，-80oC儲存備用。蛋白質裂解液保存在......閱讀全文
雙向電泳(twodimensional－electrophoresis,2DE)3
2．[操作步驟]1. 將標準品BSA(5mg/ml)先稀釋成0.5 mg/ml，2. 按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl分別加到96孔板中，加DDW補足到20μl。3. 加適當體積樣品（4μl）到96孔板的樣品孔中，加DDW到20μl。4. 各孔加入200μl G-250染色液
雙向電泳(twodimensional－electrophoresis,2DE)6
我們本次實驗使用的是銀染。銀染的方法種類很多，目前有文獻報道的就有100多種。但是其準確的染色機制還不是特別的清楚。大致的原理是銀離子在堿性pH環境下被還原成金屬銀，沉淀在蛋白質的表面上而顯色。 由于銀染的靈敏度很高，可染出膠上低于1 ng/蛋白質點，故廣泛的用在2D凝膠分析上。待找到自己感
雙向電泳(twodimensional－electrophoresis,2DE)2
2．[操作步驟] ? 1. 將研磨管離心一分鐘（不低于12000×g）棄上清。 2. 加入裂解液（200-300ul）充分vortex. 3. 再加入樣品鼠腦組織（低于100mg）充分研磨。然后可以再加入裂解液至1ml.. 4. 將組織懸液離心5-10min(高于12000
雙向電泳(twodimensional－electrophoresis,2DE)5
六、第二向 SDS-PAGE1．[基本原理]蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。如果加入一種試劑消除電荷、形狀等因素的影響，使電泳遷移率只取決于分子的大小，就可以用電泳技術測定蛋白質的分子量。1967年，Shapiro等發現在樣品介質和聚丙烯酰胺凝
雙向電泳(twodimensional－electrophoresis,2DE)1
一、蛋白質組學概論隨著人類基因組計劃的實施，生命科學步入了后基因組時代，出現了不同于以往經典生物實驗科學的全新的研究方式─“生物大科學”。這種生物大科學的核心思想是整體性研究，即以生物體內某類物質為對象進行完整的研究。過去對生命活動的研究僅限于研究細胞內個別的基因或蛋白質，而基因組學和蛋白質組學的目
雙向電泳(twodimensional－electrophoresis,2DE)4
由于合成載體兩性電解質（synthetic carrier ampholyte SCA）是通過復雜的合成過程得到的，其重復性很難控制，由此不同批次之間會存在很大的變化，同一蛋白質在不同批 圖-1. 等電聚焦的“聚焦效應” 次等電聚焦中所出現的位置有所偏差，這樣作為雙向電泳中的一向時就限
雙向凝膠電泳技術(2DE)的技術原理
雙向凝膠電泳技術與質譜技術是目前應用最為廣泛的研究蛋白質組學的方法。雙向凝膠電泳技術利用蛋白質的等電點和分子量差別將各種蛋白質區分開來。雖然二維凝膠電泳難以辨別低豐度蛋白，對操作要求也較高，但其通量高、分辨率和重復性好以及可與質譜聯用的特點，使其成為目前最流行、可靠的蛋白質組研究手段。雙向凝膠電泳技
2DE－蛋白質組學的－PROTICdb－數據庫實驗
實驗步驟：3.1 PROTICdb 概述在輸入或瀏覽數據時，每個最終用戶需要一個 PROTICdb 賬戶（由您的管理員創建 ) 。作為一個新用戶，首先要創建一個新的項目。一旦建立，該項目就屬于這個用戶，這個用戶有權授予其他用戶訪問權限。為確保數據一致性的精確度，盡量不要用手動輸入操作。因此，
2DE－蛋白質組學的－PROTICdb－數據庫實驗
儀器、耗材DBMS實驗步驟3.1 PROTICdb 概述在輸入或瀏覽數據時，每個最終用戶需要一個 PROTICdb 賬戶（由您的管理員創建 ) 。作為一個新用戶，首先要創建一個新的項目。一旦建立，該項目就屬于這個用戶，這個用戶有權授予其他用戶訪問權限。為確保數據一致性的精確度，盡量不要用手動輸入操作
2DE－蛋白質組學的－PROTICdb－數據庫實驗（四）
4. 質譜鑒定報告文件上傳PROTICdb 兼容以制表分隔的文本格式輸出的 Sequest 鑒定報告（見注釋 13) 。( 1 ) 為演示，訪問 http: //location 一 of/your/proticdb/home/demo. php。點擊? “formto? obtain? the
2DE－蛋白質組學的－PROTICdb－數據庫實驗（二）
4. 梅拉尼生成的輸出文件的上傳( 1 ) 由梅拉尼軟件生成一個檢測報告，并把它輸出到一制表分隔的文本格式文件 ( 見注釋 9)。 文件擴展名為 “ txt.? ” 。 本演示中，使用 PROTICdb? Demo,?? zip 中的 detections /DV02121001. txt 文件
2DE－蛋白質組學的－PROTICdb－數據庫實驗（一）
儀器、耗材?DBMS實驗步驟 3.1 PROTICdb 概述在輸入或瀏覽數據時，每個最終用戶需要一個 PROTICdb 賬戶（由您的管理員創建 ) 。作為一個新用戶，首先要創建一個新的項目。一旦建立，該項目就屬于這個用戶，這個用戶有權授予其他用戶訪問權限。為確保數據一致性的精確度，盡量不要用手動
2DE－蛋白質組學的－PROTICdb－數據庫實驗（六）
( 18 ) 當移動鼠標到兩個鏈接的蛋白點之一上時，與這個點鏈接的每個點的十字標記的顏色都變成橙色 （在另一塊膠上有一個匹配的蛋白點）。當鼠標點到這些點中的一個時，只有包括在同一個網絡中的點顯示橙色（ 圖 23-12)。你可以通過聲明一個新的關系，確認這些數據，這樣就可以擴大點的網絡。( 1
2DE－蛋白質組學的－PROTICdb－數據庫實驗（三）
2. 質譜鑒定命令單個蛋白質點可能被命名為幾個名稱或代碼，如檢測點數、匹配數、采集數等。因此，用一個質譜圖去關聯一個適當的蛋白點沒有多大意義。為了避免錯誤， PROTICdb 的工作流程之一是生成一個攜帶單一的，送去做質譜鑒定的蛋白點質譜儀 ID 的文件 ( 相當于一個命令)。質譜儀就可以將
2DE－蛋白質組學的－PROTICdb－數據庫實驗（五）
( 10 ) 鼠標左鍵點擊同一個點（342 號）（見注釋 20) ，激活蛋白點信息框。蛋白點的數據按以下 4 個條目排列：概要、關系、鑒定和量化。每個條目對應的信息可被不斷充實。其中鑒定包括質譜的詳細數據。( 11 ) 開發鑒定、質譜詳細數據和下一個子目錄。從質譜數據分析得到了每個匹配結果，首先得到
Delta2D－和－Proteomweaver：兩款2DE分析工具的性能評估
電泳學雜志《Electrophoresis》于2010年31卷發表了一篇Decodon公司的2-DE（2D凝膠電泳）分析軟件Delta2D (D2D)與另一款同類分析軟件Proteomweaver (PW)性能比較的文章，題目是：《Delta2D 和 Proteomweaver：兩款2-DE
二維聚丙烯酰胺凝膠電泳的樣品制備——可溶性樣品
多種用于蛋內質組學研究的蛋白質分離方法得到了發展，如基因芯片技術的應用. 蛋白復合物的質譜直接分析、親和標簽的使用以及大規模酵母雙雜交篩選系統。但是，二維聚丙烯酰胺凝膠電泳 (two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2-DE) 依然是大
二維聚丙烯酰胺凝膠電泳的樣品制備
可溶性樣品 組織樣品準備 細胞 樣品分級 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 由于2-DE 所分析樣品的多樣性，沒有一種制備方法可以普遍
二維聚丙烯酰胺凝膠電泳的樣品制備
實驗方法原理 由于2-DE 所分析樣品的多樣性，沒有一種制備方法可以普遍適用于各種樣品，但有幾點考慮一定要提出，很有必要盡量減少可能在 2-DE 譜中導致假點 (artifactualspot) 的蛋白質修飾，在實驗中，含尿素的樣品一定不要加熱，因為加熱后尿素分解產生的異氰酸鹽可能對蛋白
二維聚丙烯酰胺凝膠電泳樣品的溶解與還原
實驗方法原理 理想的 2-DE 溶解應能達到破壞所有非共價結合蛋白質復合物和聚積體，形成各個多肽的溶解液。如不能達到這一點，樣品中結合牢固的蛋白質復合物可能使 2-DE 中出現新的蛋白質點，相應地表示單個多肽的點強度將下降。此外，溶解方法必須允許可能干擾 2-DE 分離的鹽、脂類、多糖和
二維聚丙烯酰胺凝膠電泳樣品的溶解與還原
實驗方法原理理想的 2-DE 溶解應能達到破壞所有非共價結合蛋白質復合物和聚積體，形成各個多肽的溶解液。如不能達到這一點，樣品中結合牢固的蛋白質復合物可能使 2-DE 中出現新的蛋白質點，相應地表示單個多肽的點強度將下降。此外，溶解方法必須允許可能干擾 2-DE 分離的鹽、脂類、多糖和核酸等物質的去
二維聚丙烯酰胺凝膠電泳樣品的溶解與還原
基本方案 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 理想的 2-DE 溶解應能達到破壞所有非共價結合蛋白質復合物和聚積體，形成各個多肽的溶解液。如不能達到這一點，樣品中結合
雙向電泳
蛋白質組研究的發展以雙向電泳技術作為核心. 雙向電泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分離約1 000個E.coli蛋白，并表明蛋白質譜不是穩定的，而是隨環境而變化. 雙向電泳原理簡明，第一向進行等電聚焦，蛋白質沿pH梯度分離，至各自的等電點；隨后，再沿垂直的方向進行分子量
蛋白質組技術的研究進展（一）
大規模基因組測序計劃的實施已改變生命科學的重心，在相當短的時期內，一些原核生物和某些低等真核生物的基因組序列已被測定. ?1995年，流感嗜血桿菌基因組序列首次被破譯，在此后不到兩年的時間，近50個細菌的基因組序列已被完成. ?然而，這僅僅是理解有機物功能的一個起點. 在基因組時代，許多DNA序列信
Isolation－of－Cell－Wall－Proteins－from－Medicago－sativa－Stems
Plant cell walls are highly dynamic and chemically active components of plant cells. Cell walls consist primarily of polysaccharides, with protei
概述溴酚藍的配置方法
方法1：1%的溴酚藍 將托盤天平上稱取1g溴酚藍定溶于100ml無水乙醇中，轉移入滴瓶中，貼標簽備用。 方法2：0.05%的溴酚藍 配western blot用的2*SDS上樣緩沖液需要用到0.1%的溴酚藍，2-DE中溴酚藍一般也是配成0.1%母液。實際上，溴酚藍在水中的溶解度不高，直接將
溴酚藍的使用配置方法
方法1：1%的溴酚藍將托盤天平上稱取1g溴酚藍定溶于100ml無水乙醇中，轉移入滴瓶中，貼標簽備用。方法2：0.05%的溴酚藍配western blot用的2*SDS上樣緩沖液需要用到0.1%的溴酚藍，2-DE中溴酚藍一般也是配成0.1%母液。實際上，溴酚藍在水中的溶解度不高，直接將0.1g溴酚藍溶
溴酚藍的配置方法
方法1：1%的溴酚藍將托盤天平上稱取1g溴酚藍定溶于100ml無水乙醇中，轉移入滴瓶中，貼標簽備用。方法2：0.05%的溴酚藍配western blot用的2*SDS上樣緩沖液需要用到0.1%的溴酚藍，2-DE中溴酚藍一般也是配成0.1%母液。實際上，溴酚藍在水中的溶解度不高，直接將0.1g溴酚藍溶
蛋白鑒定方法之圖象分析技術
“滿天星”式的2-DE圖譜分析不能依靠本能的直覺，每一個圖象上斑點的上調、下調及出現、消失，都可能在生理和病理狀態下產生，必須依靠計算機為基礎的數據處理，進行定量分析。 在一系列高質量的2-DE凝膠產生（低背景染色，高度的重復性）的前提下，圖象分析包括斑點檢測、背景消減、斑點配比和數據庫構建。
二維聚丙烯酰胺凝膠電泳的樣品制備——組織樣品準備
實驗材料 固體組織樣品 試劑、試劑盒 溶解緩沖液 儀器、耗材 研缽 實驗步驟 固體組織樣品常在溶解緩沖液中破碎，最好的方法是在組織冷凍及液氮溫度的條件下破碎。包裹在鋁箔并貯存于液氮中的較小組織樣品，可以夾在兩個冷研塊或基體中間用杵和研缽在液氮環境下壓碎