cDNA文庫的構建
此經典方案建立在 Gubler-Hoffman 法（Gulber-Hoffman 1983) 之上，分為六個階段。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）上冊，作者：黃培堂。實驗材料λ噬菌體臂大腸桿菌菌株用于λ噬菌體的包裝抽提物試劑、試劑盒放線菌素 D二硫蘇糖醇EDTATris-ClMgCl2反轉錄酶RNase 抑制劑用于 cDNA 合成的寡核苷酸引物poly(A)+RNA[a-32P]dCTPEDTA乙醇(NH4)2SO4β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸T4 噬茵體多核苷酸激酶大腸桿菌 DNA 聚合酶 I酚氯仿乙酸鈉T4 噬菌體 DNA 聚合酶大腸桿菌 DNA 連接酶EcoRlβ-疏基乙醇溴酚蘭儀器、耗材微量離心管水浴箱SephadexG-50 離心柱過濾的壓縮空氣止血器或軟管夾帶有彎頭的皮下注射針頭無菌吸管聚乙烯管剪刀Sepharose CL-4B乙烯基泡沫管Whatman3 MM 濾紙實驗步驟階段 1: 反轉錄酶催化合成 cDNA ......閱讀全文
CDNA文庫
?CDNA文庫（主要內容如下）·?????????Construction of cDNA Library·?????????Construction of Genome DNA Library·?????????Library Screening??OthersConstruction of cD
cDNA文庫構建
cDNA文庫構建 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 cDNA 文庫是指某生物某發育時期所轉錄的全部 mRNA 經反轉錄形成的 cDNA 片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。
cDNA文庫構建
cDNA文庫構建可以：（1）用于分離全長基因進而開展基因功能研究；（2）篩選目的基因并直接用于表達；（3）提供構建分子標記連鎖圖譜的所用探針。實驗方法原理cDNA 文庫是指某生物某發育時期所轉錄的全部 mRNA 經反轉錄形成的 cDNA 片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。經典 cDNA 文庫構建
CDNA文庫篩選
CDNA文庫篩選（一）λgt11 cDNA文庫鋪平板宿主細菌制備1．用一個E.coli宿主菌株單菌落分別接種2×5ml LB培養基（Y1088用于噬菌斑雜交，Y1090用于免疫篩選），于37℃振蕩培養過夜。2．將過夜培養物以3000×g離心5min。3．分別用2ml?λ-dil（10 mmol/L
CDNA文庫篩選
（一）λgt11 cDNA文庫鋪平板宿主細菌制備1．用一個E.coli宿主菌株單菌落分別接種2×5ml LB培養基（Y1088用于噬菌斑雜交，Y1090用于免疫篩選），于37℃振蕩培養過夜。2．將過夜培養物以3000×g離心5min。3．分別用2ml?λ-dil（10 mmol/L tris-Cl,
cDNA文庫構建
cDNA文庫[原理]：cDNA文庫不同于基因組文庫，被克隆DNA是從mRNA反轉錄來源的DNA。CDNA組成特點是其中不含有內含子和其他調控序列。從而做cDNA克隆時應是先從獲得mRNA開始，在此基礎上，通過反轉錄酶作用產生一條與mRNA相互補的DNA鏈，然后除掉mRNA，以第一條DNA鏈為模板復制
cDNA文庫構建
實驗方法原理 cDNA 文庫是指某生物某發育時期所轉錄的全部 mRNA 經反轉錄形成的 cDNA 片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。經典 cDNA 文庫構建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆轉錄引物，或者用隨機引物，給所合成的 cDNA 加上適當的連接接頭，連接到適當的載體中獲得文庫。其基
cDNA－文庫的構建
? ? ? ? ? ? 實驗材料 λ噬菌體臂 大腸桿菌菌株 用于λ噬菌體的包裝抽提物 試劑、試劑盒 放線菌素 D
cDNA－文庫的構建
此經典方案建立在 Gubler-Hoffman 法（Gulber-Hoffman 1983) 之上，分為六個階段。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）上冊，作者：黃培堂。實驗材料λ噬菌體臂大腸桿菌菌株用于λ噬菌體的包裝抽提物試劑、試劑盒放線菌素 D二硫蘇糖醇EDTATris-ClMgCl2反轉錄酶
cDNA文庫的物化方法
基因工程初始階段所用的方法，已不用。利用核酸雙螺旋之間存在著堿基G C，A T配對特性，分離目的基因。 例如：海膽rDNA分子內其G C含量可以達63%（其穩定性高，溶解溫度高），通過熱變性和S1酶解處理可得到提純50倍的rDNA，最后經氯化銫平衡梯度離心，得到相對分子量為1.9X107Dal
cDNA－文庫的構建2
階段 3:cDNA 的甲基化材料緩沖液和溶液將貯存液稀釋到合適濃度。氯仿10XEcoRⅠ 緩沖液1XEcoRⅠ 甲基化酶緩沖液（選用)如希望，可替代步驟 1 中的 Tris-HCl,NaCl 和 EDTA。EDTA(0.5mol/L,pH8.0)乙醇MgCl2(1mol/L)NaCl(5mol/L)
cDNA－文庫的構建3
階段 5:SepharseCL-4B 凝膠過濾法分離 cDNA材料緩沖液和溶液乙醇乙酸鈉（3 ml/L,pH5.2)TE(pH7.6)含 0.1mol/LNaCl 的 TE(pH7.6)Tris-HCl(1mol/L,pH8.0)凝膠瓊脂糖凝膠（1%)見步驟 8。核酸和寡核苷酸cDNA階段 4 中步
cDNA文庫的構建3
接頭-銜接子與cDNA的連接8.將下列試劑加入到已削成平末端的DNA中：10×T4噬菌體DNA聚合酶修復緩沖液 2μl800~1000 ng 的磷酸化接頭或銜接子 2μlT4噬菌體DNA連接酶（105 Weiss單位/ml） 1μl10 mmol/L ATP 2μl混勻后，在16℃溫育8~12h。9
cDNA文庫的構建1
分為六個階段：階段1：反轉錄酶催化合成cDNA第一鏈階段2：cDNA第二鏈的合成階段3：cDNA的甲基化階段4：接頭或銜接子的連接階段5：Sepharose CL-4B凝膠過濾法分離cDNA階段6：cDNA與λ噬菌體臂的連接 [階段1：反轉錄酶催化合成cDNA第一鏈] 1.在置于冰上的無菌微
cDNA文庫的構建2
10. Sephadex G-50用含有10 mmol/L NaCl的TE(pH7.6)溶液進行平衡，然后通過離子柱層析將未摻入的dNTP和 cDNA分開。11. 加入0.1倍體積的3mol/L乙酸鈉（pH5.2）和2倍體積的乙醇，沉淀柱層析洗脫下來的cDNA，將樣品置于冰上至少15分鐘，然后在微量
cDNA－文庫的構建（四）
方法cDNA 末端的削平1.cDNA樣品（來自步驟 11)于 68°C 加熱5 min。這一步驟是使cDNA分子的單鏈突出端可能形成的雙鏈結構發生變性。2. 將cDNA溶液冷卻至37°C并加入下列試劑：5xT4噬菌體DNA聚合酶修復緩沖液 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
cDNA－文庫的構建（二）
7. 盡可能快地進行 cDNA 合成的下一步驟階段 2:cDNA 第二鏈的合成材料緩沖液和溶液將貯存液稀釋到合適濃度。氯仿EDTA(0.5mol/LpH8.0)乙醇MgCl2(1mol/L)(NH4)2SO4(1mol/L)將 1.3 g 固體硫酸銨溶解于終體積為 10 ml 的水中，溶液經濾膜過濾
關于cDNA文庫的簡介
cDNA文庫（cDNA library）：是指某生物某一發育時期所轉錄的mRNA全部經反轉錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。 cDNA文庫是以特定的組織或細胞mRNA為模板，逆轉錄形成的互補DNA（cDNA）與適當的載體（常用噬菌體或質粒載體）連接后轉化受體菌形成重組DNA
差減cDNA文庫法
差減cDNA文庫法[第一條鏈cDNA合成]1．合成第一條cDNA鏈時，所有試劑應按下列順序依次加入：10×第一條鏈合成緩沖液?????????????????5.0μl10mM dNTP Mix(1.4μg/μl)???????????????2.5μl(終濃度1.25mM)Linker prime
cDNA－文庫的構建（三）
階段 3:cDNA 的甲基化材料緩沖液和溶液將貯存液稀釋到合適濃度。氯仿10XEcoRⅠ 緩沖液1XEcoRⅠ 甲基化酶緩沖液（選用)如希望，可替代步驟 1 中的 Tris-HCl,NaCl 和 EDTA。EDTA(0.5mol/L,pH8.0)乙醇MgCl2(1mol/L)NaCl(5mol/L)
cDNA－文庫的構建（一）
實驗材料 λ噬菌體臂大腸桿菌菌株用于λ噬菌體的包裝抽提物試劑、試劑盒 放線菌素 D二硫蘇糖醇EDTATris-ClMgCl2反轉錄酶RNase 抑制劑用于 cDNA 合成的寡核苷酸引物poly(A)+RNA[a-32P]dCTPEDTA乙醇(NH4)2SO4β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸T4
構建cDNA文庫的層析柱cDNA分級
這一步稍不注意會影響成功性或影響獲得的cDNA的片段分布特點。這一步的操作要小心，尤其要在加入cDNA之前通過反復懸浮和試滴保證柱子能正常工作，cDNA的加入和收集要精力集中。獲得的每一級的cDNA量很少，檢測時帶型很暗，所以要用新鮮做的透明薄膠檢測，根據檢測結果一定要舍棄太短的cDNA（一般4
cDNA文庫構建技術cDNA鏈的反轉合成
構建cDNA文庫是一種獲得目標基因并進一步進行基因重組,基因克隆的重要方法,而在該文庫構建中有mRNA 逆轉錄出cDNA是一步極為關鍵的操作。mRNA的逆轉錄主要由MMLV、AMV兩種逆轉錄酶催化合成cDNA，在這個逆轉錄過程中，模板mRAN及逆轉錄酶是兩個最重要的影響因素。對于mRNA來講，一
cDNA文庫構建技術cDNA鏈的反轉合成
實驗概要構建cDNA文庫是一種獲得目標基因并進一步進行基因重組，基因克隆的重要方法，而在該文庫構建中有mRNA 逆轉錄出cDNA是一步極為關鍵的操作。mRNA的逆轉錄主要由MMLV、AMV兩種逆轉錄酶催化合成cDNA，在這個逆轉錄過程中，模板mRAN及逆轉錄酶是兩個最重要的影響因素。對于mR
cDNA文庫組標準流程6
2．pBlueScriptII的雙酶切消化 1．以如下體系進行EcoRI酶切： pBSK(+) X μl（6μg） ddH2O 174-X μl 10×Buffer E 20 μl 混勻，加入限制性內切酶： EcoRI （10U/ μl） 6 μl 總體積為200 μl。 2．輕彈管壁或用槍頭輕輕吹
cDNA文庫組標準流程2
(二)動物組織totalRNA的提取 1．根據表1選擇適當的組織量和相應的變性裂解液量，將變性裂解液分裝到RNase-free的50ml無菌離心管中，冰浴5分鐘。 2．將組織樣品放入變性裂解液中，在高速下勻漿15-30秒/次，直到看不見組織和細胞碎片。 3．根據表1加入適量2M的乙酸鈉（pH4.0）
cDNA文庫組標準流程1
一.Total RNA的提取 (一) 試劑配制 準備工作： 1.研缽、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml /100ml容量瓶、藥匙、 試劑瓶等玻璃制品均用錫紙包裹口部，置于烤箱內,180℃，烤6小時。 2.50ml/1.5ml離心管、槍頭等塑料
差減cDNA文庫法1
[第一條鏈cDNA合成] 1.合成第一條cDNA鏈時，所有試劑應按下列順序依次加入： 10×第一條鏈合成緩沖液5.0μl 10mMdNTPMix(1.4μg/μl)2.5μl(終濃度1.25mM) Linkerprimer(1.4μl，終濃度100μg/μl) DEP
cDNA文庫組標準流程5
4EcoRIadaptor加接:1.往雙鏈 cDNA沉淀中加入9ulEcoRI adaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分鐘以充分溶解cDNA沉淀;2.溶解完成后,順序加入下列試劑:1.2ul 10×Ligase Buffer1ul 10mMrATP1ul T4DNA Ligase(4U
cDNA文庫組標準流程4
三．cDNA雙鏈合成1.SupersciptII —RT合成第一鏈:1.在一RNase-free的0.2mlPCR管中,加入xul mRNA(大約500ng)1ul XhoIPrimer(1.4ug/ul)(5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTT